猴頭菇菌絲體和發酵液中多糖的含量測定

劉曉明?閆云宇?畢華?高振強

1.河北省食品藥品檢驗院，河北石家莊 050011；2.河北醫科大學第三醫院，河北石家莊 050051

[摘要] 目的 分別測定猴頭菇菌絲體、猴頭菇發酵液提取的粗多糖中的多糖含量。 方法 采用蒽酮-硫酸比色法，利用紫外分光光度計測定多糖含量，樣品與對照品分別在450～750 nm波長范圍內掃描。 結果 最大吸收波長為（625±1）nm，猴頭菇多糖檢測濃度在20～100?g/mL（r2=0.999）范圍內與吸光度線性關系良好；加樣回收率為96.0%。 結論 猴頭菇菌絲體與發酵液提取的粗多糖中多糖含量均能達到30%以上。

[關鍵詞] 猴頭菇菌絲體；猴頭菇發酵液；多糖；含量測定

[中圖分類號] S646 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）06-94-02

猴頭菌（Hericium erinaceus，Bull.Ex Fr.）又名猬菌、刺猬菌、小刺猴頭、猴菇、猴頭菇，隸屬于擔子菌門，齒菌科[1]，是著名的藥食兩用菌。猴頭菇味甘，性平，歸脾、胃經。猴頭菇多糖是猴頭菌的主要活性成分之一，具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗突變、防輻射等作用[2]。猴頭菇多糖制成的藥物和保健品深受人們喜愛，開發前景廣闊。目前，通過猴頭菇子實體提取猴頭菇多糖的方法研究較多，但猴頭菇子實體的生長周期相對較長，本文研究的是發酵的方法獲得的多糖，具有生長周期短，提取多糖速度快的特點。因此，液體深層發酵是開發猴頭菇活性成分的有效手段。但是在發酵獲得多糖的方法中，采用菌絲體提取多糖的研究較多，而積極利用發酵液提取多糖的方法較少報道，本實驗通過對猴頭菇菌絲體和發酵液提取的多糖含量進行比較，把發酵液也積極的利用起來，為猴頭菇多糖更好的開發利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫外可見分光光度儀GBC Cintra10（澳大利亞GBC公司），高效液相（美國Waters公司），旋渦混合振蕩器（江蘇海門其林醫用儀器廠），恒溫水浴鍋（北京靖衛科學儀器廠）。D-無水葡萄糖（中國藥品生物制品檢定所），蒽酮（北京金

龍化學試劑有限公司），濃硫酸、95%乙醇、氯仿均為分析純，猴頭菇菌種為本實驗室保存。

1.2 多糖的提取與精制

1.2.1 猴頭菇菌絲體的多糖提取[3] 取猴頭菇成熟的菌絲體粉末（20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批）各5 g，加入20倍的水在80℃水浴中提取3 h，5000 r/min離心10 min[2]，取上清液。60℃下減壓濃縮至30 mL，過濾，濾液離心，取上清液，加入5倍體積的無水乙醇，靜置過夜。抽濾，沉淀經無水乙醇、丙酮洗滌，置干燥箱中60℃干燥，得粗多糖。

1.2.2 猴頭菇菌絲體發酵液的多糖提取[4] 取猴頭菇成熟的菌絲體發酵液（20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批），過濾，濾液離心，取上清液1000 mL。60℃下減壓濃縮至300 mL，過濾，濾液離心，取上清液，加入5倍體積的無水乙醇，靜置過夜。抽濾，沉淀經無水乙醇、丙酮洗滌，置干燥箱中60℃干燥，得粗多糖。

1.3 含量測定方法的建立

1.3.1 葡萄糖對照品溶液的配制[5] 精密稱取105℃干燥至恒重葡萄糖標準品25 mg用蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，制成濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液，備用。

1.3.2 供試品溶液的制備 猴頭菇多糖適量配制成濃度約為30 ?g/mL的溶液。樣品溶液取1 mL加入4 mL 0.1%蒽酮-硫酸溶液，搖勻，置沸水中煮沸10 min，取出迅速放冷，在黑暗中放置10 min。顯色后樣品采用用紫外分光光度法在波長625 nm下測定含量。

1.3.3 蒽酮-硫酸溶液的配制[6] 取98%硫酸和蒸餾水適量，配制成72%硫酸液，精密稱取蒽酮適量，用72%的硫酸溶液配制成含蒽酮0.1%的蒽酮-硫酸溶液。

1.3.4 吸收波長選擇 取對照品適量配制成濃度為30 ?g/mL的溶液。再取樣品猴頭菇多糖適量配制成濃度約為30 ?g/mL的溶液。對照品、樣品溶液各取1 mL分別加入0.1%蒽酮-硫酸液4 mL，搖勻，置沸水中煮沸10 min，取出迅速放冷，在黑暗中放置10 min。顯色后將葡萄糖對照品、猴頭菇多糖樣品在紫外分光光度儀中分別在450～750 nm波長范圍內掃描，結果猴頭菇多糖樣品和葡萄糖對照品最大吸收波長分別在625.2 nm和625.8 nm，故選定（625±1）nm為測定波長。

1.3.5 標準曲線的制備[7] 精密稱取葡萄糖對照品配成0.5 mg/mL的溶液，從中分別吸取0 mL（空白），0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置于10 mL容量瓶中用蒸餾水定溶至刻度，配制成濃度為0、20、40、60、80、100 ?g/mL的溶液，作3組與此同樣的平行樣品。

2 結果

2.1 標準曲線

精密吸取每組中各個濃度對照品溶液1 mL分別置于試管中，照1.3.2項下顯色方法顯色，在625 nm波長處測定吸光度值，計算得回歸方程：Y=0.007X-0.0133，r2=0.999。結果表明，葡萄糖液在20～100 ?g/mL與吸光度值呈良好的線性關系。根據測定結果計算標準曲線方程。本方法適用于測定濃度在20～100 ?g/mL的猴頭菇多糖。

2.2 精密度試驗

精密稱取0.1572 g樣品，定容于100 mL容量瓶中，待溶解完全后，精密量取1 mL定溶于10 mL容量瓶中，再取1 mL于試管中，共配制5份同樣的稀釋液，按標準曲線項下操作。結果RSD為0.13%（n=5），表明精密度良好。

2.3 穩定性實驗

取同一份供試品（A）和對照品（B）溶液，按標準曲線項下操作，進行紫外測定。每隔15 min測定一次紫外吸收值，樣品的RSD值為0.74%（n=8），對照品的RSD值為0.50%（n=8）。由實驗結果可知，此方法在2 h內穩定可行，超過2 h后樣品和對照品均有較大變化，因此本實驗在進行含量測定時，應該在2 h內完成。

2.4 回收率實驗

取猴頭菇多糖的干燥粉末，精密加入葡萄糖對照品適量，照2.4項下方法操作，計算回收率。結果平均回收率為96.0%，RSD為1.12（n=6）。見表1。

2.5 猴頭菇多糖樣品溶液的含量測定

精密稱取20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批猴頭菇菌絲體提取的粗多糖和猴頭菇菌絲體發酵液提取的粗多糖約0.16 g用蒸餾水定溶于100 mL，精密量取1 mL該溶液分別稀釋至10 mL，將稀釋液分別按2.4項下操作測定吸光度。含量測定得樣品中多糖含量見表2。

3 結論

目前對猴頭菇菌絲體提取多糖的報道較多，而對其發酵液的多糖提取及利用較少。實驗中本研究采用蒽酮-硫酸比色法分別對猴頭菇菌絲體和發酵液提取的粗多糖進行含量測定。結果表明兩者提取的粗多糖含量相差較小，均在30%以上，因此通過發酵生產猴頭菇多糖時，菌絲體和發酵液均可獲得可利用的多糖。積極利用起發酵液提取粗多糖，可以有效的提高猴頭菇粗多糖的產量，從而更好的開發其產品。

[參考文獻]

[1] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：上海科學技術出版社，1999： 522-524.

[2] 胡斌杰，師兆忠.超聲法提取猴頭菇多糖最佳工藝優化研究[J].化學世界，2009，9：557-560.

[3] 吳志明，李公斌，新秀蘭，等.猴頭菇多糖的提取工藝[J].食品研究與開發，2011，32（7）：36-38.

[4] 張樹海.猴頭菇多糖提取及純化的研究[J].食品研究與開發，2006， 27（11）：103-106.

[5] 陳勇，朱炳輝，陸惠文.猴頭菇口服液中多糖的分離和測定[J].中國藥品標準，2002，3（4）：21-23.

[6] 李紹平，黃趙剛，張平，等.蒽酮-硫酸法測定亮菌糖漿中多糖的含量[J].中草藥，2002，33（3）：233-235.

[7] 白云娥，李青山，王毅，等.冬蟲夏草多糖的含量測定[J].山西醫科大學學報，2000， 31 （2）：129-130.

（收稿日期：2013-02-18）