臭馬比木莖段離體培養研究初報

陳劍鋒　李克克　王承恩等

摘要：以臭馬比木（Nothapodytes nimmoniana）帶芽莖段作外植體進行離體培養，研究了不同基本培養基和激素濃度對其側芽萌發的影響。結果表明，基本培養基類型對臭馬比木莖段外植體帶芽莖段的萌發有極顯著影響，以WPM作為基本培養基，側芽萌發率和增殖系數極顯著高于MS和B5培養基。正交試驗結果顯示WPM+0.5 mg/L TDZ+1.5 mg/L 6-BA最適于臭馬比木莖段的離體培養，側芽萌發率和增殖系數分別為96.8%和1.14。

關鍵詞：臭馬比木（Nothapodytes nimmoniana）；莖段；離體培養

中圖分類號：S567.1+9；S339.4+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1692-03

臭馬比木（Nothapodytes nimmoniana （Graham） Mablerley）又名青脆枝，屬茶茱萸科假柴龍樹屬（Nothapodytes sp.）多年生植物，原產于我國臺灣蘭嶼。臭馬比木全株均含喜樹堿，且含量遠高于喜樹，是提取抗癌藥物喜樹堿的優質原料[1]。喜樹堿及其系列衍生物對胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等十多種癌癥均有特殊療效，已成為抗腫瘤藥物的主要品種[2]。喜樹堿需求量的不斷增加導致喜樹堿原材料資源面臨枯竭的危險，臭馬比木的野生資源也大幅減少，在一些國家已被列為敏感物種[3]。臭馬比木以種子繁殖為主，產苗量低且成株時間長，遠遠不能滿足市場的需求。因此，利用組織培養技術快速繁育臭馬比木，并在培養過程中利用技術手段增加組培苗中的喜樹堿含量，對合理有效利用資源、提供優質的喜樹堿提取原料具有重要意義[4-6]。本研究以臭馬比木的帶芽莖段為外植體進行離體培養，初步建立離體快繁技術，旨在為臭馬比木的快速繁殖、優良品種的保存及工廠化生產提供相關依據。

1 實驗方法

1.1 臭馬比木外植體的接種

實驗用臭馬比木材料取自仲愷農業工程學院鐘村種質資源圃，為兩年生植株，取健壯無病蟲害枝條，洗凈后剪取帶有1～2個側芽的莖段作為外植體，流水清洗1 h以上，用體積分數75%的乙醇表面滅菌10 s，無菌水漂洗2～3次后用1 g/L HgCl2溶液滅菌15 min，再用無菌水漂洗3～5次，將消毒后的莖段隨機接種在培養基上，培養條件為溫度（25±2）℃、光照度1 600 lx、光照時間16 h/d。

1.2 基本培養基對臭馬比木側芽萌發率和增殖系數的影響

分別以MS、WPM及B5為基本培養基，均添加7 g/L瓊脂、30 g/L蔗糖、0.05 mg/L TDZ和0.1 mg/L 6-BA，pH 6.0，每處理接種50個外植體（帶有70個側芽），重復3次。接種30 d后統計外植體存活率、側芽萌發率及增殖系數。

存活率=存活外植體個數/接種的外植體總數×100%

萌發率=萌發側芽的外植體個數/存活的外植體個數×100%

增殖系數=萌發的側芽個數/存活的外植體個數

1.3 正交試驗

采用三因素三水平正交設計[7]考察基本培養基類型、TDZ濃度和6-BA濃度對外植體側芽萌發率和增殖系數的影響，因素與水平見表1，正交試驗每處理接種50個外植體（帶有70個側芽），30 d后統計側芽萌發率和增殖系數。

2 結果與分析

2.1 培養基對臭馬比木側芽萌發的影響

分別以MS、WPM及B5為基本培養基，臭馬比木帶芽莖段外植體接種15～25 d后側芽即開始萌動，30 d后各培養基中外植體存活及側芽萌發的情況見表2。從表2可以看出，基本培養基類型對外植體存活率的影響不大，各處理差異不顯著（P>0.05），但對莖段側芽的萌發率和增殖系數有較大影響，WPM作基本培養基時側芽萌發率和增殖系數均極顯著高于MS和B5基本培養基（P<0.01），且芽苗健壯，長勢良好（圖1A）。MS作基本培養基時萌發的芽苗葉片薄而發黃，苗生長細弱，伸長不明顯（圖1B）；B5作基本培養基時側芽萌動較慢，30 d時芽苗生長不明顯（圖1C）。且培養后期MS和B5培養基中均出現了不同程度的褐化現象。

2.2 正交試驗結果

正交試驗結果見表3。從表3可以看出，各因素中基本培養基類型對莖段側芽萌發率和增殖系數的影響最大，其次是TDZ濃度，6-BA濃度對莖段離體培養的影響最小。方差分析表明，基本培養基類型對莖段側芽萌發率和增殖系數的影響達極顯著水平，TDZ濃度對莖段側芽萌發率和增殖系數的影響達顯著水平，6-BA濃度對莖段側芽萌發率和增殖系數的影響不顯著。最佳培養條件組合為A2B3C1，即以WPM為基本培養基，附加0.5 mg/L TDZ 和1.5 mg/L 6-BA，此條件下側芽萌發率為96.8%，增殖系數為1.14，均高于其他正交試驗組合的結果。取莖段外植體接種于該培養基中，側芽萌發和生長情況見圖2，可見芽苗生長健壯、長勢良好。

3 小結與討論

木本植物由于本身的特點，組織培養通常很難實現脫分化，本身易出現褐化、生根難、培養周期長等問題[8]，同時有研究發現木本植物的愈傷組織和胚狀體的誘導較為困難，且許多研究結果不一致，難以形成定論[9]。以莖段為外植體進行組織培養，經短時間直接分化出芽是一條有效的快速繁殖途徑[10]。組織培養的成功與否與培養基類型有很大關系，不同基本培養基中無機離子、有機營養物質含量各異，這些均是組織培養中外植體賴以生存和生長的基礎[11]。臭馬比木離體莖段組織培養過程中，培養基的類型和激素種類及配比是影響側芽萌發和生長的關鍵因素。本實驗對MS、B5、WPM 3種基本培養基進行了篩選，發現臭馬比木離體莖段側芽在WPM培養基中的萌發率遠高于MS、B5培養基，這與紅豆杉[12]、喜樹[13]、銀杏[14]等的研究結果一致。3種培養基中WPM培養基中的NH4+與NO3-濃度之比為1∶1，而MS和B5培養基中的NO3-濃度均高于NH4+。臭馬比木離體莖段在MS、B5培養基中褐化明顯，這是否與培養基中離子濃度和N源濃度高有關還需進一步研究[11]。

植物生長調節物質是培養基中的關鍵物質，雖用量極小，但在組織培養中起著重要的作用。基本培養基只能保證外植體的生存與最低的生理活動，只有加入適當的植物生長調節劑后才能誘導細胞分裂的啟動、愈傷組織的形成以及根、芽的分化[15，16]。不同功能激素的配比是影響外植體成功啟動的重要因子，組織培養中常用細胞分裂素和生長素的組合作為生長調節物質，但由于外植體本身內源激素水平的差異，在添加外源調節劑時要對外源調節劑的種類和濃度加以選擇和優化。本實驗在預實驗過程中發現，6-BA與TDZ的組合更有利于臭馬比木莖段側芽的萌發，正交試驗結果表明WPM+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ更適于臭馬比木莖段側芽的萌發。培養基的組成成分不同，對植物細胞的生長及次生代謝物的產生也有較大的影響，在實驗優化的培養基中對臭馬比木莖段進行離體培養，是否有利于臭馬比木植株中喜樹堿含量的提高還有待進一步的研究[17]。

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