卡拉庫爾羊TNF—α基因原核表達載體的構建及表達條件優化

賀艷艷　潘輝　王娟娟等

摘要：利用反轉錄PCR（RT-PCR）技術擴增卡拉庫爾羊腫瘤壞死因子α（TNF-α）基因，連接到pET-28b載體，轉化大腸桿菌BL21（DE3），在不同的IPTG濃度、時間、溫度條件下誘導TNF-α的表達。結果表明，原核表達載體pET-28b-TNF-α構建成功，可在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達，優化的誘導表達條件為誘導溫度37 ℃、誘導時間4 h、IPTG濃度1.0 mmol/L。

關鍵詞：腫瘤壞死因子α（TNF-α）；原核表達；表達條件

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1686-03

腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）是一類具有多種生物學活性的細胞因子，在體內具有特異性殺傷腫瘤細胞、免疫調節、抗病毒、抗寄生蟲、代謝調控、造血及炎癥前反應等多種作用[1-3]。近年來對TNF-α及其阻斷劑在臨床應用方面的研究獲得了可喜的成果[4-7]。本研究通過反轉錄PCR（RT-PCR）技術擴增卡拉庫爾羊TNF-α基因，構建重組質粒pET-28b-TNF-α轉化大腸桿菌（E. coli）BL21（DE3）菌株，對TNF-α的表達條件進行優化，以期為研究卡拉庫爾羊TNF-α在機體內的作用、生物學活性及其在動物疾病治療、飼料開發等方面的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）菌株、表達載體pET-28b（+）均由新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室保存；Taq DNA聚合酶、限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、X-Gal、IPTG、dNTPs、DNA Marker、PrimeScript Reverse Transcriptase試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨（AP）、Tris、TEMED等購自生工生物工程（上海）股份有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒和AxyPrep質粒DNA小量試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pET-28b-TNF-α的構建與鑒定 提取卡拉庫爾羊淋巴細胞總RNA，反轉錄獲得cDNA，PCR擴增TNF-α基因，上下游引物分別為PF， 5′-GGCGAATTCCTCCCGTCTGGACTTGGATC-3′（劃線部分為EcoR Ⅰ酶切位點）；RF， 5′-GGCCTCG

AGGGACACCTTGACCTCCTGAAT-3′（劃線部分為Xho Ⅰ酶切位點）。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切PCR產物和pET-28b原核表達載體。回收后用T4連接酶連接，將連接產物轉入大腸桿菌DH5α中培養，挑取陽性克隆進行酶切及測序鑒定。

1.2.2 卡拉庫爾羊TNF-α融合蛋白的誘導表達 將重組質粒pET-28b-TNF-α轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，在含50 mg/L卡那霉素的LB培養基中搖菌過夜，后取1 μL轉接到100 μL新鮮的含50 mg/L卡那霉素的LB培養基。分別在不同的誘導溫度（37、39、42 ℃）、時間（1、2、3、4 h）和IPTG濃度（0.5、1.0、1.5 mmol/L）條件下進行TNF-α融合蛋白的誘導表達。誘導表達后收集1 mL表達菌，4 ℃、12 000 r/min離心1 min，棄上清，加入2×SDS緩沖液20 μL和2 μL 二硫蘇糖醇（DTT），渦旋混勻，12 000 r/min離心1 min，100 ℃加熱5 min以使蛋白質變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測表達的融合蛋白[8]。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR擴增卡拉庫爾羊TNF-α基因

以卡拉庫爾羊淋巴細胞RNA為模板，反轉錄獲得cDNA，利用設計好的引物擴增得到卡拉庫爾羊TNF-α基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，結果見圖1。從圖1可以看出，擴增產物條帶清晰明亮，長度約為1 300 bp，與預期目標片段大小相符，測序結果表明得到的擴增產物長度為1 268 bp，與已知的TNF-α基因序列一致。

2.2 卡拉庫爾羊重組原核表達質粒pET-28b-TNF-α的鑒定

將構建的重組原核表達質粒pET-28b-TNF-α轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，挑單菌落進行菌液PCR鑒定，對陽性菌落提取質粒進行EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切鑒定，結果見圖2。從圖2可以看出，質粒雙酶切后得到明顯的兩條條帶，大小分別為1 300 bp和5 000 bp左右。

2.3 TNF-α融合蛋白的誘導表達

將含有表達載體pET-28b-TNF-α的大腸桿菌BL21（DE3）菌株在不同溫度和時間條件下培養，添加不同濃度的IPTG進行TNF-α融合蛋白的誘導表達。SDS-PAGE檢測表達產物，結果見圖3。采用BandScan 5.0軟件對電泳結果進行分析，結果表明誘導溫度37 ℃、1.0 mmol/L IPTG、誘導4 h時的蛋白表達量較高，占菌體蛋白表達量的21.6%（圖4）。

3 小結與討論

大腸桿菌BL21（DE3）表達系統是一個便捷的、能在體外高效表達真核基因的系統，該系統不能進行蛋白質的翻譯后修飾，因而對外源基因表達后大多數產物通常以包涵體形式存在，導致蛋白沒有活性。但大腸桿菌BL21（DE3）系統能讓研究者獲得較滿意的蛋白表達量，從而為以后的實驗提供大量的蛋白原料。

在原核表達系統中除了需要表達菌株，還需要表達載體，pET系列載體在原核表達載體中較為常用，可利用誘導劑IPTG對外源蛋白的表達進行調控。本實驗選用了技術非常成熟的融合型原核表達載體pET-28b，pET-28b全長5 369 bp，帶有卡那青霉素抗性篩選基因，該載體包括T7啟動子、LacZ操縱子序列、LacI調控基因、多克隆位點等。該載體還含有6個組氨酸標簽，當用Ni-NTA樹脂純化蛋白時，6個組氨酸標簽與其有很強的親和性，這樣有利于蛋白的純化。此外，融合表達能提高目的蛋白的表達量，降低外源蛋白對表達宿主菌細胞的毒性。

影響蛋白表達的因素很多[9-15]，本研究只選擇了3個，即誘導溫度、誘導時間和IPTG濃度。溫度和時間是影響融合蛋白誘導表達的重要因素，選擇合適的誘導溫度和時間可以促進菌體的生長，提高產物的表達量。但培養時間過長會導致菌體代謝產生的毒素積累，從而影響菌體生長，降低蛋白的表達水平。IPTG對蛋白的表達有促進作用，其濃度過高也會抑制大腸桿菌的生長。本試驗結果表明，卡拉庫爾羊TNF-α融合蛋白在37 ℃、1.0 mmol/L IPTG的條件下誘導4 h，表達量達最高。

參考文獻：

[1] CARSWELL E， OLD L J， KASSEL R L， et al. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，1975，72（9）：3666-3670.

[2] 銀 梅，日穆德瑪，王鳳龍. 雞腫瘤壞死因子的提取及其免疫活性的研究[J]. 甘肅畜牧獸醫，2004，34（6）：13-16.

[3] SEMENZATO G. Tumour necrosis factor： A cytokine with multiple biological activities[J]. British Journal of Cancer，1990， 61（3）：354-361.

[4] OTTAVIANI E， FRANCHINI A， FRANCESCHI C. Presence of several cytokine-like molecules in molluscan hemocytes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1993，195（2）：984-988.

[5] OTTAVIANI E， CASELGRANDI E， FRANCESCHI C. Cytokines and evolution： In vitro effects of IL-1α， IL-1β， TNF-α and TNF-β on an ancestral type of stress response[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1995，207（1）：288-292.

[6] WITTWER D， FRANCHINI A， OTTAVIANI E， et al. Presence of IL-1-and TNF-like molecules in Galleria mellonella（Lepidoptera） haemocytes and in an insect cell line from Estigmene acraea（Lepidoptera）[J].Cytokine，1999，11（9）：637-642.

[7] BODMER J L， SCHNEIDER P， TSCHOPP J. The molecular architecture of the TNF superfamily[J]. Trends in Biochemical Sciences，2002，27（1）：19-26.

[8] SANBROOK J， FRITSCH E， MANIATIS T， et al. 分子克隆實驗指南[M]. 金冬雁，黎孟楓譯. 第二版. 北京：科學出版社，1992.

[9] 楊明凡，陳紅英，張素梅，等.長白豬腫瘤壞死因子α成熟肽基因克隆、表達及其表達產物活性檢測[J].畜牧獸醫學報，2011，42（8）：1145-1149.

[10] 王曉玲，葉林柏，郜金榮，等.人新型腫瘤壞死因子在E. coli中的高效表達、純化及誘導凋亡活性[J]. 武漢大學學報（理學版），2001，47（2）：205-208.

[11] 高春萍.黑鯛腫瘤壞死因子cDNA的克隆與體外表達的研究[D].山東青島：中國海洋大學，2004.

[12] 任文軒. 重組人腫瘤壞死因子（rhTNF-α）在大腸桿菌中的搖瓶表達、復性與同時純化[D]. 西安：西北大學，2009.

[13] 蔡中華，宋林生，ZOU J，等.虹鱒腫瘤壞死因子（TNFα）基因體外表達與純化的研究[J].水生生物學報，2003，27（6）：596-601.

[14] 蔡中華，宋林生，高春萍，等.真鯛腫瘤壞死因子α（TNFα）cDNA的克隆與表達[J].生物化學與生物物理學報（英文版），2003，35（12）：1111-1116.

[15] 邱麗華，宋林生，蔡中華，等. 花鱸腫瘤壞死因子基因cDNA的克隆、分析與表達[J]. 中國水產科學，2003，10（5）：370-375.