響應(yīng)面法優(yōu)化佛手總黃酮提取工藝

劉玉芬　夏海濤

摘要：以乙醇溶液為提取溶劑從佛手（Citrus medica var. sarcodactylis）中提取總黃酮，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以佛手總黃酮提取率為指標(biāo)，選擇提取溫度、提取時(shí)間和液料比3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，優(yōu)化佛手總黃酮的提取工藝條件。結(jié)果表明，優(yōu)化的提取工藝條件為體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作提取溶劑、提取溫度69 ℃、提取時(shí)間1.9 h、液料比V乙醇∶m佛手粉=32∶1 （mL/g）、提取2次，該條件下佛手總黃酮提取率為0.565 9%。

關(guān)鍵詞：佛手（Citrus medica var. sarcodactylis）；總黃酮；提取工藝；響應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）07-1634-04

佛手（Citrus medica var. sarcodactylis）又名佛手柑，為常綠小喬木或灌木，是蕓香科柑橘屬植物香櫞（C. medica）的變種，主要分布在我國(guó)浙江、廣東、廣西、福建、云南、四川和安徽等地，是傳統(tǒng)的名貴中藥材，全株均可入藥[1-3]。佛手果性味辛、苦、甘、溫，無(wú)毒，入肝、脾、胃、肺經(jīng)，具有和胃健脾、舒肝理氣、止咳化痰之功效，主治肝郁氣滯、飲食不振、胃腹脹滿(mǎn)、嘔吐、咳嗽痰多、婦科疾病等[4-6]。研究表明佛手果中主要含有蛋白質(zhì)、維生素、黃酮、多糖、香豆素類(lèi)及其聚合體、有機(jī)酸、揮發(fā)油、礦物質(zhì)等化學(xué)成分[7-11]，對(duì)防治胃癌、肝癌、肺癌，抑制腫瘤生長(zhǎng)，擴(kuò)張冠狀血管、增加冠脈的血流量，減緩心率和降低血壓，激活免疫細(xì)胞、改善機(jī)體免疫功能等也具有一定的功效[12-14]。目前對(duì)采用超聲波法等對(duì)佛手總黃酮進(jìn)行提取的研究已有報(bào)道[15，16]。本研究以乙醇溶液為浸提溶劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)佛手總黃酮提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)佛手產(chǎn)品和深入研究佛手化學(xué)成分的藥理作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中藥佛手原產(chǎn)地為廣東，購(gòu)自安徽省亳州市藥材市場(chǎng)，在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干至恒重，粉碎過(guò)20目篩。用石油醚浸泡去色，重復(fù)3次，余下的固體粉末揮發(fā)干備用。乙醇、石油醚等試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所。

主要試驗(yàn)設(shè)備有UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）、RE-5285A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）、DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）、TDL-4型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 佛手總黃酮提取工藝流程 稱(chēng)取佛手干粉5 g，置于三口瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件加入一定量的乙醇溶液在一定溫度下浸泡提取一定時(shí)間，離心并收集提取液，減壓濃縮后定容，測(cè)定提取液中的總黃酮含量。

1.2.2 佛手總黃酮提取率的測(cè)定 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，參照文獻(xiàn)[17]得到蘆丁質(zhì)量濃度（C）在5～40 mg/L范圍內(nèi)對(duì)其在363 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為A=0.005 6+0.029 0C，r=0.999 8。測(cè)定佛手總黃酮提取液的吸光度A363 nm，計(jì)算其中的總黃酮含量，由下式得到佛手總黃酮的提取率。

佛手總黃酮提取率=提取液中總黃酮含量×稀釋倍數(shù)×體積/原料質(zhì)量×100%。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 設(shè)置單因素試驗(yàn)分別考察乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、液料比（V乙醇∶m佛手粉，mL/g，下同）、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)佛手總黃酮提取率的影響。①乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)。在提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1 h、液料比25∶1、提取1次的條件下，分別以體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液作為提取溶劑。②提取時(shí)間。在提取溫度70 ℃、液料比25∶1、提取1次、體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作提取溶劑的條件下，提取時(shí)間分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h。③提取溫度。在液料比25∶1、提取1次、體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作提取溶劑、提取時(shí)間1 h的條件下，提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃。④液料比。在提取1次、體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作提取溶劑、提取時(shí)間1 h、提取溫度70 ℃的條件下，液料比分別為10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1。⑤提取次數(shù)。在①～④優(yōu)化的條件下分別提取1、2、3次。

1.2.4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量，以佛手總黃酮提取率為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素水平編碼設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.05統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)佛手總黃酮提取率的影響 在提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1 h、液料比25∶1、提取1次的條件下，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液提取總黃酮，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，佛手總黃酮提取率隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大先升高，在乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)總黃酮提取率最高，之后再增加乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)，總黃酮提取率下降。乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)會(huì)使脂溶性和醇溶性雜質(zhì)溶出量增大，導(dǎo)致總黃酮提取率下降，故乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)選擇60%為宜。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)佛手總黃酮提取率的影響 以體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作為提取溶劑，考察不同提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，總黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)先升高，提取時(shí)間超過(guò)2.0 h時(shí)總黃酮提取率不再升高，反而略有下降，因此，提取時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，以2.0 h為宜。

2.1.3 提取溫度對(duì)佛手總黃酮提取率的影響 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，總黃酮提取率隨著提取溫度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，提取溫度為70 ℃時(shí)總黃酮提取率最高，提取溫度過(guò)低不利于黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出，溫度過(guò)高則有可能導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)被分解，因此提取溫度以70 ℃左右為宜。

2.1.4 液料比對(duì)佛手總黃酮提取率的影響 不同液料比對(duì)總黃酮提取率的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，佛手總黃酮提取率隨提取溶劑用量的增大也呈先升高后下降的趨勢(shì)，V乙醇∶m佛手粉=30∶1 （mL/g）時(shí)總黃酮提取率最大。提取溶劑用量少則黃酮提取不完全，而溶劑用量增大會(huì)導(dǎo)致成本增加，因此以V乙醇∶m佛手粉=30∶1為宜。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)佛手總黃酮提取率的影響 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，總黃酮提取率隨提取次數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)，但提取次數(shù)由2次增加到3次，總黃酮提取率升高的幅度不大，綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素及減少操作環(huán)節(jié)，以重復(fù)提取2次為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)一步考察提取溫度、提取時(shí)間和液料比3個(gè)因素對(duì)佛手總黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。將所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.05軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到總黃酮提取率對(duì)提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、液料比（C）的二次多項(xiàng)回歸方程Y=0.566 0

-0.009 2A-0.005 7B+0.007 7C-0.007 6AB+0.012 7AC-0.004 8BC-0.025 6A2-0.033 7B2-0.016 1C2。對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，模型P<0.000 1，表明響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.638 5>0.05，不顯著，模型的校正確定系數(shù)R2=0.992 1，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.981 9，表明該方程較好地反映了提取溫度、提取時(shí)間和液料比對(duì)佛手總黃酮提取率的影響，可用此模型對(duì)佛手總黃酮的提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由方差分析結(jié)果知，除交互項(xiàng)BC對(duì)總黃酮提取率影響顯著（P<0.05）外，其他項(xiàng)的影響均達(dá)極顯著水平（P<0.01）。

回歸模型的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖6。在所選試驗(yàn)條件范圍內(nèi)存在響應(yīng)面最高點(diǎn)。由圖6a可知，當(dāng)液料比固定為30∶1時(shí)，總黃酮提取率隨提取溫度和時(shí)間的增加先呈上升趨勢(shì)，提取溫度和時(shí)間分別為68.47 ℃和1.94 h時(shí)總黃酮提取率最大，此后有所下降。高溫環(huán)境下黃酮類(lèi)物質(zhì)易于氧化，結(jié)構(gòu)被破壞，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，黃酮浸出率達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，雜質(zhì)的溶出量增加，也導(dǎo)致總黃酮提取率下降。由圖6b可知，固定提取時(shí)間為2 h，在V乙醇∶m佛手粉=32.12∶1（mL/g）、溫度為68.37 ℃時(shí)可以達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)。圖6c表明固定提取溫度為70 ℃，在V乙醇∶m佛手粉=32.65∶1（mL/g）、提取時(shí)間為1.87 h附近可以達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)。各兩因素交互作用的等高線(xiàn)均呈橢圓形，表明各兩因素交互作用較強(qiáng)，影響顯著[18]。

通過(guò)軟件Design-Expert求解回歸方程，得到佛手總黃酮的最佳提取工藝條件為提取溫度68.85 ℃、提取時(shí)間1.91 h、V乙醇∶m佛手粉=32.06∶1（mL/g），佛手總黃酮提取率理論最高值可達(dá)0.567 5%。考慮實(shí)際操作情況，將試驗(yàn)條件修改為提取溫度69 ℃、提取時(shí)間1.9 h、V乙醇∶m佛手粉=32∶1（mL/g）。在此條件下以體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作提取溶劑，提取2次，重復(fù)3次，所得佛手總黃酮提取率為0.565 9%，與預(yù)測(cè)值偏差很小，證明該模型用于優(yōu)化篩選佛手總黃酮提取工藝是可行的。

3 小結(jié)與討論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法建立了佛手總黃酮提取率與提取溫度、提取時(shí)間和液料比的二次多項(xiàng)回歸模型，優(yōu)化得到的最佳提取工藝修正條件為提取溫度69 ℃、提取時(shí)間1.9 h、V乙醇∶m佛手粉=32∶1（mL/g）。經(jīng)驗(yàn)證該模型擬合程度高，準(zhǔn)確有效。在此條件下得到的實(shí)際佛手總黃酮提取率與預(yù)測(cè)值基本吻合，說(shuō)明Box-Behnken 設(shè)計(jì)法用于中藥佛手中總黃酮提取工藝的優(yōu)化是可行的。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張瑞芳，高幼衡，崔紅花. 三種不同產(chǎn)地佛手的傅立葉變換紅外光譜鑒別[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（1）：48-50.

[2] 梁永樞，許楚煒，段 啟.佛手研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2006， 8（5）：25-27.

[3] 石健泉，蔣運(yùn)寧. 佛手特征及栽培技術(shù)[J].廣西園藝，2006， 17（1）：20-22.

[4] 趙 磊，籍保平，周 峰，等.十二種金華佛手揮發(fā)油成分的比較研究[J]. 食品科學(xué)，2006，27（6）：179-183.

[5] 趙興杰，籍保平，趙 磊，等.佛手揮發(fā)油不同提取方法的比較研究[J].食品科學(xué)，2007，28（4）：167-170.

[6] 尹 鋒，樓鳳昌.佛手化學(xué)成分的研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2004， 39（1）：20-21.

[7] 楊榮華.佛手柑精油化學(xué)成分的分析[J].分析化學(xué)，30（9）：1149.

[8] 崔紅花，高幼衡，梁盛林，等.川佛手化學(xué)成分研究（I）[J].中草藥，2007，38（9）：1304-1306.

[9] 李吉鋒，高錦紅，祝寶林.5種蕓香科植物微量元素主成分分析[J].青島科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，28（5）：400-402.

[10] 張福平，連少虹，陳蔚輝.佛手柑黃酮類(lèi)化合物提取工藝研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2005，26（8）：99-101.

[11] 金曉玲，曹詣斌，徐麗珊，等. 佛手氨基酸及多糖含量的測(cè)定[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，25（1）：66-68.

[12] 章 斌，侯小楨. 復(fù)合酶法提取廣佛手總黃酮的工藝[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2010，31（10）：188-192

[13] 郭衛(wèi)東，鄭建樹(shù)，鄧 剛，等.佛手揮發(fā)油抑菌活性的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24（8）：103-107.

[14] 王婷婷，譚紅軍，張和平，等.佛手的研究與應(yīng)用開(kāi)發(fā)[J]. 重慶中草藥研究，2011（1）：38-40.

[15] 章 斌，侯小楨，饒 強(qiáng).響應(yīng)面優(yōu)化佛手總黃酮超聲提取及抗氧化研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33（2）：27-31.

[16] 姜立春，黃成思，楊 澈，等. 川佛手總黃酮提取及抗氧化性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（2）：340-342.

[17] 夏海濤，劉玉芬，董超男，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化野生馬蘭頭總黃酮的提取工藝[J].食品科學(xué)，2011，32（24）：191-195.

[18] 張玉香，屈慧鴿，楊潤(rùn)亞.響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉黃酮的微波提取工藝[J].食品科學(xué)，2010，31（16）：33-37.