紅花蜂花粉多糖提取工藝的優化及其抗氧化性質研究

左紹遠　錢金栿

摘要：采用水提醇沉法從紅花（Carthamus tinctorius L.）蜂花粉中提取多糖，以多糖提取率為指標，設計正交試驗優化多糖提取的工藝條件，并觀察紅花蜂花粉多糖在體外的抗氧化作用。結果表明，紅花蜂花粉多糖的最佳提取工藝條件為提取溫度90 ℃、提取時間12 h、料水質量比1∶15；此工藝條件下多糖平均得率為2.35%。體外抗氧化結果表明，紅花蜂花粉多糖對羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）有一定的清除作用。

關鍵詞：紅花（Carthamus tinctorius L.）蜂花粉多糖；提取；正交試驗；抗氧化

中圖分類號：S646；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1631-03

紅花（Carthamus tinctorius L.）為菊科紅花屬一年生草本植物，味辛、性溫，具有活血通經、祛瘀止痛等功效[1，2]，是一種傳統中藥。紅花在中國的人工種植歷史悠久，新疆維吾爾自治區、云南省和四川省是紅花的主產區，尤其在滇西地區紅花已大量推廣種植，成為新的蜜源植物，紅花蜂花粉的產量逐年上升，已成為滇西地區新的農業產業之一。多糖是一類結構復雜的生物大分子物質，具有多種復雜的生物學活性。研究表明，不同來源的多糖具有增強機體免疫力、調節血糖、降血脂及抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種活性[3，4]，多糖類已成為功能性食品和新藥物資源的研究熱點之一。目前對蜂花粉多糖研究較多[5]，但關于紅花蜂花粉多糖的研究少見報道。為綜合開發利用云南省豐富的紅花蜂花粉資源，對紅花蜂花粉多糖的分離提取工藝及其體外抗氧化活性進行了研究，以期為擴大紅花蜂花粉的用途及促進紅花蜂花粉深加工產品的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-葡萄糖標準品為Sigma公司產品，乙醇、丙酮、乙醚等試劑為國產分析純。破壁紅花蜂花粉為云南滇峰蜂業有限責任公司產品（批號：20100902）。

主要儀器包括HH-W420/600恒溫水浴箱（金壇市瑞華儀器有限公司）、AG 135電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、RE-52A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、FD-1型冷凍干燥機（北京博醫康技術有限公司）、UV2550型紫外可見分光光度計（日本島津蘇州儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制[6] 精確稱取在105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標準品100.0 mg置100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解后定容至100 mL，得葡萄糖標準儲備液。吸取儲備液10.0 mL置100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得葡萄糖標準應用液（100 μg/mL）。精確吸取應用液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80 mL，分別置于具塞試管，加蒸餾水補至2.0 mL，加質量分數6.0%的苯酚1.0 mL，各管迅速加5.0 mL濃H2SO4，搖勻，沸水加熱10 min，迅速流水冷卻，另取2.0 mL蒸餾水同法操作，加入試劑作空白對照，在490 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標、葡萄糖質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，葡萄糖質量濃度（C）在10～80 μg/mL范圍內與吸光度A490 nm有較好的線性關系，回歸方程為A=0.006 1C+0.007 2，r2=0.998 4。

1.2.2 紅花蜂花粉多糖的提取工藝流程與多糖提取率的測定 稱取破壁紅花蜂花粉150.0 g，分別用石油醚、95%（體積分數，下同）的乙醇回流2次，每次2 h。濾渣加蒸餾水水浴浸提2次，合并濾液，減壓濃縮至適當體積后加95%的乙醇至乙醇體積分數為75%，醇沉，置4 ℃過夜，離心，沉淀用Sevage法脫蛋白[6]至280 nm處無明顯吸收峰后再次醇沉，沉淀用蒸餾水透析12 h，醇沉，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，-20 ℃冷凍干燥至恒重，得紅花蜂花粉粗多糖樣品，置玻璃干燥器中備用。精確稱取紅花蜂花粉粗多糖樣品100.0 mg，按“1.2.1”方法操作，測定吸光度。根據葡萄糖標準曲線計算出粗多糖樣品中多糖的質量分數。

多糖提取率=多糖質量分數×粗多糖樣品質量/蜂花粉質量（干重）×100%

1.2.3 正交試驗 選擇提取時間、提取溫度、料水質量比為考察因素，采用L9（34）正交試驗表設計試驗（表1），以紅花蜂花粉多糖提取率為考察指標，篩選最佳提取條件。

1.2.4 紅花蜂花粉多糖對羥基自由基（·OH）的清除作用[7，8] 將多糖樣品配制為濃度分別為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL的溶液，各取1.0 mL，分別加入9.0 mmol/L FeSO4、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇各1.0 mL，對照組以蒸餾水1.0 mL代替多糖溶液。最后加8.8 mmol/L H2O2啟動反應，37 ℃水浴反應0.5 h后以蒸餾水調零，在510 nm波長處測定吸光度。以不加H2O2的多糖溶液作為本底管，維生素C作陽性對照品，同法操作。每個質量濃度做3個平行管，結果取平均值。

清除率=（A0-Ax-Ax0）/A0×100%

式中，A0為對照組吸光度，Ax為多糖樣品吸光度，Ax0為本底管吸光度。

1.2.5 紅花蜂花粉多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用 采用鄰苯三酚自氧化法進行測定[9，10]。多糖樣品溶液配制同“1.2.4”，取pH 8.2的Tris-HCl緩沖液0.50 mL于具塞試管，加不同質量濃度的多糖溶液1.0 mL置25 ℃水浴保溫20 min后，再加入在25 ℃預熱的5.0 mmol/L鄰苯三酚溶液0.5 mL，混勻后25 ℃水浴4 min，快速搖勻，在325 nm處以pH 8.2的Tris-HCl緩沖液調零，每隔30 s測定1次吸光度，連續測定4 min，計算加入多糖樣品后的自氧化速率△Ax。空白對照組以1.0 mL蒸餾水溶液代替多糖樣品，測定自氧化速率△A0。以維生素C作陽性對照同法操作。

自氧化速率=（最后一次測定的吸光度-第一次測定的吸光度）/4

清除率=（△A0-△Ax）/△A0×100%

2 結果與分析

2.1 紅花蜂花粉多糖提取正交試驗結果

紅花蜂花粉多糖提取正交試驗結果見表2。由極差分析可知各因素對多糖提取率的影響由大到小依次為提取溫度、提取時間、料水質量比。最佳試驗組合為A3B3C3，即提取溫度90 ℃、浸提時間12 h、料水質量比1∶20。方差分析結果表明提取溫度和提取時間對提取率的影響顯著（P<0.05），而料水質量比對提取率的影響不顯著（P>0.05）。這可能是由于原料為破壁蜂花粉，水溶性多糖容易浸出，故料水質量比對提取率的影響相對較小。由于增加提取劑水的用量會使后續減壓濃縮、醇沉等工藝的成本增加，故從實際出發，本試驗選擇料水質量比為1∶15，此條件下紅花蜂花粉多糖的提取率為2.386%，高于其他正交試驗組合的結果。進行驗證試驗，重復3次，多糖提取率分別為2.38%、2.27%、2.41%，平均提取率為2.35%（RSD=2.56%），表明優化的工藝組合具有較高的提取率，工藝穩定可行。

2.2 紅花蜂花粉多糖對·OH的清除作用

紅花蜂花粉多糖對·OH的清除試驗結果見圖1。從圖1可以看出，在試驗范圍內紅花蜂花粉多糖和維生素C對·OH的清除率隨其質量濃度的升高而上升。質量濃度低于0.30 mg/mL時，多糖對·OH的清除率較低，而多糖質量濃度從0.30 mg/mL增加到0.40 mg/mL，清除率從10.50%迅速上升至36.56%，在質量濃度為0.60 mg/mL時，多糖對·OH的清除率為56.23%，是相同質量濃度陽性對照品維生素C對·OH清除率的74%。

2.3 紅花蜂花粉多糖對O2-·的清除作用

紅花蜂花粉多糖對O2-·的清除試驗結果見圖2。由圖2可知，在試驗范圍內，隨紅花蜂花粉多糖和維生素C質量濃度的增加，其對O2-·的清除率逐漸上升，且呈一定的劑量效應關系。在多糖質量濃度為0.60 mg/mL時，其對O2-·的清除率為47.36%，是相同質量濃度陽性對照品維生素C對O2-·清除率的64%。

3 小結與討論

本試驗考察了水提醇沉法提取紅花蜂花粉多糖的工藝條件，優化的工藝條件為提取溫度90 ℃、提取時間12 h、料水質量比1∶15，在該條件下多糖提取率為2.35%，為紅花蜂花粉多糖的開發和利用提供了試驗依據。體外抗氧化活性試驗表明，紅花蜂花粉多糖具有一定的清除·OH和O2-·的作用，且在試驗范圍內其清除能力隨多糖質量濃度升高而增強，呈現出一定的劑量效應關系。但在相同的質量濃度下，多糖對·OH和O2-·的清除率低于維生素C，表明多糖在體外的抗氧化能力弱于維生素C。但多糖作為一種純天然抗氧化物質，具有毒副作用小、來源廣等特點，因而可長期使用[11，12]。有關紅花蜂花粉多糖的生物學活性及單糖組成、結構等尚待進一步研究。

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