轉OsCYP2基因水稻后代的遺傳分析及農藝性狀觀察

閆海生　雷闖　馬凌霄等

摘要：通過對轉OsCYP2基因水稻（Oryza stativa L.）吉農大30后代的PCR檢測，發現轉基因后代中大部分株系分離比率符合3∶1的遺傳比率，依此推斷該部分植株中插入片段的遺傳分離方式符合孟德爾遺傳規律；對轉基因植株及對照植株（吉農大30）的農藝性狀進行觀察比較后發現轉基因植株的平均穗長、穗粒數、結實率、株高以及千粒重等性狀表現低于對照，但是分蘗數明顯增加，生育期延長，而且轉基因株系之間變異性較大。

關鍵詞：水稻（Oryza stativa L.）；轉基因；OsCYP2基因；遺傳分離比例；農藝性狀

中圖分類號：S511 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1510-02

由于基因工程育種可以打破植物雜交的種間隔離，實現不同物種之間基因的轉移與整合，以獲得其他育種方法難以得到的優良性狀，因而應用基因工程進行育種工作具有巨大的價值。隨著轉基因方法、技術的改進，轉基因技術在在育種領域顯現出越來越大的應用前景[1]。完善的轉化技術要求外源基因能夠在轉化體及其后代中得到穩定、高效的表達，基因工程能否在創造新種質、新品種方面得到成功應用也完全取決于外源基因在轉基因植物中能否保持穩定的遺傳表達，因此開展外源基因在轉基因植物中遺傳表達的穩定性研究具有重要意義[2]。另一方面，轉化體農藝性狀的表現一直是育種工作者關心的問題之一，也決定了轉基因作物能否被直接應用。從已有的報道來看，轉基因當代植株及其自交衍生后代農藝性狀與原親本相比一般表現較差[3-7]。本研究以轉OsCYP2基因水稻（Oryza stativa L.）為材料，對其后代進行分子檢測以及農藝性狀觀察，旨在為轉OsCYP2基因水稻的進一步研究及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以吉林農業大學水稻育種課題組前期獲得的轉OsCYP2基因水稻吉農大30 T2代植株為材料，并以非轉基因吉農大30為對照。

1.2 試驗方法

試驗于2011年在吉林農業大學農學院抗鹽堿水稻試驗田及吉林省白城市鎮賚縣鹽堿試驗田進行，分別種植轉基因水稻T2代植株及對照植株。苗期采用潮霉素進行初步篩選，水稻插秧后剪取幼嫩葉片，使用改良后的CTAB法提取DNA，采用35S啟動子特異引物組合（F：5′ATGGATTTGTAGAGAGAGAC 3′，R：5′CTAGGAGAGCTFGCCGCAGT 3′）進行擴增檢測。擴增體系為20 μL體系，引物（濃度均為10 μmol/mL）各1 μL，DNA模板（100 ng/μL）1 μL，2×PCR mix 10 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠進行目的條帶的檢測，對陰性植株和陽性植株數量進行統計，并進行χ2測驗以確定其分離比例。根據檢測結果分別調查水稻生育期、株高、分蘗、穗長、每穗粒數、結實率及千粒重等農藝性狀并與對照進行比較與分析。

2 結果與分析

2.1 轉基因水稻的分子檢測及遺傳分析

PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后進行檢測并拍照記錄，部分檢測結果如圖1所示。由圖1可以看出，陽性植株的DNA經35 S啟動子特異引物組合擴增產生了205 bp的目標擴增條帶，而陰性植株中未出現相同條帶，說明所檢測基因片段可以傳遞到下一代植株中。統計陽性植株與陰性植株數量并進行χ2測驗，共檢測31個株系，其中有20個株系符合3∶1的分離規律，即有64.5%的轉基因株系陽性植株與陰性植株比例為3∶1，遺傳方式符合孟德爾遺傳，其余株系分離比與3∶1的遺傳比例不符，出現不同的分離比可能是由于目的基因片段插入方式、位置以及數量的不同而導致，其原因有待進一步驗證。

2.2 轉基因植株的農藝性狀

轉基因植株與對照植株的農藝性狀統計結果見表1。由表1可知，轉基因植株的平均穗長、每穗粒數、結實率、株高以及千粒重等性狀表現均比對照差，但是分蘗數明顯增加，生育期延長，而且轉基因株系之間各性狀變異性較大，其原因可能是外源基因插入或組織培養導致變異發生。

3 小結與討論

通過對轉OsCYP2基因水稻后代的DNA檢測及田間農藝性狀的觀察，發現轉基因后代中大部分株系分離比率符合3∶1的遺傳比率，依此推斷該部分植株中插入片段的遺傳分離方式符合孟德爾遺傳規律；對轉基因植株及對照植株的農藝性狀進行比較后發現轉基因植株的平均穗長、每穗粒數、結實率、株高以及千粒重等性狀與對照相比表現較差，但是分蘗數明顯增加、生育期延長，而且轉基因株系之間各性狀變異較大，推測其原因可能是由于外源基因的插入以及組織培養所造成。

隨著分子遺傳學的發展，轉基因技術在現代農業育種中得到了極為廣泛的應用，各種功能基因被轉入不同植株以獲得新的育種材料，并在許多領域取得了較大進展，在水稻抗鹽堿育種方面，曾有科學家將甜菜堿生物酶合成基因codA及betA等導入水稻中以獲得鹽堿抗性增強的水稻材料[8，9]，將OsCYP2等親環素類基因導入水稻植株中以增強抗性的研究正在廣泛開展[10]，轉基因后代中插入基因的遺傳穩定性對于轉基因材料的育種應用價值至關重要。一般來說，由基因槍法導入的外源基因插入位置及拷貝數等均存在較大的差異，難以進行控制，后代遺傳方式也較為復雜；而農桿菌介導法導入的基因拷貝數一般較少，整合位置較為固定，故其遺傳穩定性較好。本研究中所檢測株系大部分符合孟德爾遺傳定律，也初步驗證了這一說法，進一步的驗證有待于Southern雜交等實驗的進行。

在轉基因植株農藝性狀的表現方面，大量的試驗表明轉基因植株的農藝性狀在早代一般表現較大變異，有利變異與不利變異均較為常見，而隨著世代的增加其農藝性狀會逐漸趨向于與原受體材料相同，究其原因一般認為是由于早代植株受到外源基因插入及組織培養對于受體材料遺傳物質的平衡影響較大[11]，本試驗中的農藝性狀觀察結果也驗證了這一說法。而對于轉OsCYP2基因水稻的其他特征特性則有待于進一步更為詳細的試驗研究。

參考文獻：

[1] 李書欽，余顯權，趙福勝，等.轉ipt基因雜交水稻F1的遺傳特性及其主要農藝性狀分析[J].貴州農業科學，2008，36（2）：8-10.

[2] 吳 剛，崔海瑞，舒慶饒，等. cry1Ab基因在轉基因“克螟稻”后代中的遺傳穩定性及表達[J].農業生物技術學報，2000，8（3）：253-256.

[3] 崔海瑞，王中華，舒慶饒，等.轉Bt基因水稻克螟稻雜交轉育后代農藝性狀的研究[J].中國水稻科學，2001，15（2）：101-106.

[4] LYNCH P T， JONES J， BLACKHALL N W， et al. The phenotypic characterisation of R2 generation transgenic rice plants under field and glasshouse conditions[J] Euphytica，1995，85：395-401.

[5] 崔海瑞，舒慶堯，項友斌，等.轉cry1A（b）基因水稻的田間表現[A].朱睦元，李亞南.生命科學探索與進展[C].杭州：杭州大學出版社，1998.810-816.

[6] HAYASHIMOTO A， LI Z， MURAI N， et al. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants[J]. Plant Physiol，1990，93（3）：857-863.

[7] PENG J Y， KONONOWICZ H， HODGES T K. Transgenic indica rice plants[J]. Theor Appl Genet，1992，83（6-7）：855-863.

[8] 王中華，舒慶堯，夏英武，等.基因工程在水稻改良方面的研究進展[J].生物技術通報，1999（2）：5-8.

[9] 楊有才，周清明.轉基因水稻研究進展[J].湖南農業大學學報，2003，29（1）：85-88.

[10] 張忠巨. 水稻側根發育基因OsCYP2的克隆和功能分析[D].杭州：浙江大學，2007.

[11] 郭建夫，黃永相，蔣世河，等. 轉基因水稻恢復系對其雜種F1主要農藝性狀的影響[J].西南農業學報，2006，19（5）：772-776.