安絡小皮傘鎮痛作用糖蛋白純化方法研究

高 陽，楊獻玲，徐多多

(1.長春中醫藥大學研發中心,長春 130117;2.吉林省食品藥品檢驗所，長春 130021)

安絡小皮傘(Marasmius androsaceus)俗稱鬼毛針，是一種真菌，屬擔子菌綱、傘菌目、白蘑科小皮傘屬。為進一步了解安絡小皮傘糖蛋白的純化、制備方法[1]，筆者對其進行不同方法的分離，結合對小鼠的醋酸扭體抑制實驗，對各種分離方法的結果進行了比較，為安絡小皮傘的進一步開發利用提供依據。

1 儀器與材料

1.1 材料 安絡小皮傘浸膏由吉林新華藥業提供。葡萄糖標準品、標準牛血清蛋白、標準葡萄糖醛酸均為Sigma公司產品，純度為99%。其余試劑均為國產分析純。試劑甲、試劑乙為本實驗室配制。大孔吸附樹脂D101(國產);DEAE-Sephadex A-50，為Sigma公司產品。

1.2 儀器 BSZ-100A自動部分收集器；752紫外可見分光光度計;Mettler-Toledo天平AB204-N(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；德國Christ Alphal-2型冷凍干燥機；氣相色譜為溫嶺福立分析儀器公司GC-9790及N-2000雙通道色譜工作站，1%OV-225不銹鋼填充柱(Φ2 mm×2 m)。

2 實驗方法

2.1 安絡小皮傘糖蛋白的制備 安絡小皮傘菌絲體發酵物加重蒸水熱水浴攪拌，離心，殘渣棄去，合并上清液，濃縮，加乙醇至醇含量為80%,攪拌、靜置過夜、離心，醇沉部分干燥，加水溶解，離心，上清液冷凍干燥，得安絡小皮傘粗糖蛋白。

2.2 樣品的分離

2.2.1 DEAE-Sephadex A-50離子交換柱分離純化浸膏多糖 取樣品10 g以60 mL重蒸水溶解，離心后上樣，分別以蒸餾水0.2、0.4、.8 mol/L NaCl溶液洗脫，合并各部分洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到4部分樣品，收率依次為19%、10%、8%、0.3%(除蒸餾水洗脫部分外，其余各部分需經透析后再冷凍干燥)。

2.2.2 大孔樹脂柱層析 取樣品50 g以500 mL重蒸水溶解，離心后上樣，分別以重蒸餾水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇,濃縮后分別冷凍干燥得到4部分，收率依次為56.9%、19.2%、11.5%、0.1%。

2.3 樣品理化性質的測定 樣品以葡萄糖為標準品，苯酚硫酸法測定總糖含量[2]；以牛血清白蛋白為標準品，Lowry法測定蛋白質含量[3]；以葡萄糖醛酸為標準品，間羥基聯苯法測定糖醛酸含量[4]。分子量分布采用高效液相色譜法進行了測定，將樣品用0.7%硫酸鈉溶液溶解樣品配置成5 mg/mL，島津液相色譜系統：10AT-VP泵，示差折光檢測器，并采用GPC多糖專用軟件處理;單糖組成利用氣相色譜法對樣品的糖醇乙酸酯衍生物進行分析[2]。

2.4 經超濾分離樣品的分子量分布測定 采用高效液相色譜法對超濾分離的兩部分樣品分子量分布進行測定，希望通過結合藥理實驗結果了解分子量的不同對活性的影響。

2.5 不同分離方法分離得到的樣品鎮痛實驗

2.5.1 藥品與儀器 樣品為本實驗室按照前述方法制備。陽性藥為阿司匹林,醋酸。動物：昆明種小鼠(清潔級)，體質量18～22 g，雌雄兼用，隨機分組，每組10只。

2.5.2 實驗方法 小鼠禁食(自由進水)24 h后,按照表中所述劑量，灌胃給予受試藥物連續10 d后，再腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL/只，觀察記錄注射醋酸后20 min內小鼠扭體次數。

3 實驗結果

3.1 不同方法分離得到的樣品理化性質的測定 見表1。

表1 不同分離方法得到的樣品理化性質測定結果

實驗結果表明，各部分樣品糖醛酸很低，主要是由糖和蛋白構成的糖蛋白類物質，其中糖蛋白部分中的糖主要由葡萄糖和甘露糖組成。

3.2 超濾樣品分子量分布的測定 濃縮液分子量23 018，為90%；超濾液分子量770，為54%。

3.3 鎮痛實驗 見表2～表4。

表2 不同分離部分對乙酸導致小鼠扭體反應的影響(±s,n=10)

表2表明，不同洗脫部分均具有明顯的鎮痛作用，鎮痛作用基本相同。

表3 D101樹脂柱分離各部分對乙酸導致小鼠扭體反應的影響(±s,n=10)

表3表明，30%和60%乙醇洗脫部分均具有明顯的鎮痛作用，水洗脫部分與醇洗脫部分相比活性較弱。

表4 濃縮液、超濾液對乙酸導致小鼠扭體反應的影響(±s,n=10)

表4表明，超濾液和濃縮液均具有明顯的鎮痛作用。

4 小結

本實驗研究結果為進一步開發和利用安絡小皮傘奠定了一定的基礎:1)3種方法均可對安絡小皮傘糖蛋白部分起到分離和純化的作用，通過離子交換柱層析的方法和通過超濾的方法均可將安絡小皮傘糖蛋白部分按照攜帶電荷的不同或分子量大小不同進行分離。但是所得到的各個部分雖然攜帶電荷不同或分子量不同，但均具有相似的鎮痛作用。2)通過大孔樹脂柱層析的方法可將安絡小皮傘糖蛋白部分分離得到不同極性的部分，極性最大的水洗脫部分活性很弱，但極性較小的部分具有很高的活性，說明可通過該方法有效富集有效部分，使活性成分更加集中。水洗脫的部分糖蛋白極性大，但活性較弱，隨著極性的增加，安絡小皮傘糖蛋白鎮痛作用有所降低。3)在一定的范圍內，糖的含量、蛋白的含量以及不同的分子量，對安絡小皮傘糖蛋白的鎮痛作用無明顯影響。表明多種糖蛋白均具有鎮痛作用。

[1]Isolation G Q,characterization of glycopeptides with analgesic activities from Marasmius androsaceus[M].Carbohydrate polymers,2012.

[2]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].杭州:浙江大學出版社,1999:11-12,40.

[3]Li j w,Xiao N G,Yu R Y,et al.Theories and Methods of Biochemical Experiment[M].Beijing:peking university press,1994:160-176.

[4]Nelly B K,Gustar A H.New method for quantitative determination of uronc acid[J].Anal Biochem,1973(54):484-487.