高效免疫調節劑對S180肉瘤小鼠IL-6及IL-10表達的調節作用

常欣峰,宋春花,羅寶英,羅亞楠,李 歡,黃志華,韓立民*

(1.湖南中醫藥大學，長沙 410007；2.贛南醫學院，江西 贛州 341000)

腫瘤的發生、發展和轉移與機體的免疫狀態密切相關。研究[1-2]表明，腫瘤患者都會出現不同程度的免疫功能下降現象,如NKC活性、CD4+/CD8+比值、IL-2含量等均呈下降趨勢，這是腫瘤得以無限增長的一個重要因素。而腫瘤的生長又通過分泌免疫抑制因子進一步抑制宿主免疫功能，從而形成惡性循環[3]。近年來,腫瘤的生物治療得到長足的發展，在改善患者生存質量，降低復發率方面的重要作用已得到越來越多的認可和重視。腫瘤的生物治療成為繼手術、放療、化療之后的第四大治療方法。目前國內外有關腫瘤生物治療包括：免疫調節劑治療、腫瘤細胞瘤苗治療、過繼性T細胞治療-CIK、樹突細胞疫苗治療和造血干細胞移植治療等五大方法。筆者通過對已上市疫苗進行的篩選研究，確定了多價疫苗應用的處方(HIS)，并申請了中國發明專利(申請號：200810107096.6)。在前期工作中，已完成對HIS急性和3個月長期毒性實驗的觀察。本次實驗以S180肉瘤小鼠為模型，通過計算脾指數、抑瘤率及檢測IL-6、IL-10，初步探討HIS對免疫系統的影響及抑瘤機理。

1 材料

1.1 動物及瘤株 SPF級昆明小鼠40只，雄性，6～8周齡，體質量18～22 g,由湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2009-0004，合格證號,4300016645。S180瘤株，由中國醫學科學院醫藥研究所購進，贛南醫學院科研中心傳代培養。

1.2 藥品及試劑 高效免疫調節劑(HIS)，由江中腫瘤治療研究組提供，批號：110325;環磷酰胺，白色粉狀針劑，0.2 g/支，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產，批號：12041125；IL-6放免檢測試劑盒購自北京普爾偉業生物科技有限公司，批號：20120820;IL-10多克隆抗體購自博士德生物工程有限公司(貨號:BA1201)；BCA蛋白定量試劑盒購自天根生化科技有限公司(貨號：A：Lot#J9122；B：Lot#J8830)。

1.3 儀器 SN-695型智能放免γ測量儀(上海核福光電儀器有限公司),賽多利斯BS224S型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，MK3型酶標儀(美國Thermo公司)。垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)，化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 S180肉瘤小鼠模型的建立 于超凈工作臺，無菌條件下抽取接種S180瘤株7 d的小鼠腹水，呈淡奶白色，生理鹽水稀釋后,1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，用生理鹽水將細胞重懸，苔盼藍染色，腫瘤活細胞比率>95%，調整細胞濃度為1×107個/mL，置于冰水中保存。75%乙醇消毒,0.2 mL/只接種于小鼠右腋部皮下，正常對照組接種同體積的生理鹽水。

2.2 分組及給藥 接種后次日，將40只小鼠隨機分為4組,即正常對照組、S180肉瘤模型組、S180肉瘤模型加環磷酰胺組(CTX組)、S180肉瘤模型加高效免疫調節劑組(HIS組)，每組10只。CTX組于小鼠腹腔注射CTX，50 mg/kg；HIS治療組給予腹股溝皮下注射濃度為0.03 g/mL的HIS 0.1 mL/10 g體質量,終劑量為0.3 g/kg；正常對照組及S180肉瘤模型組腹腔注射等容積生理鹽水。以上各組均3 d給藥1次。連續10 d(即給予4次藥物治療)。

2.3 瘤重、抑瘤率及脾指數測定 于末次給藥24 h后，稱體質量，取血，取脾臟、腫瘤，電子天平稱脾臟及腫瘤質量。

2.4 放射免疫學方法檢測血清IL-6水平 摘眼球取血置于促凝管中，4 ℃、3 000 r/min，離心10 min，制備血清，-80 ℃保存。送往北京普爾偉業生物科技有限公司代檢。

2.5 Western blot法檢測腫瘤組織細胞因子IL-10表達 于-80 ℃冰箱中稱取腫瘤組織20～30 mg，以預冷的PBS清洗并用眼科剪將組織剪碎于1.5 mL EP管中，再加入適量的蛋白裂解液研磨，4 ℃顛倒混勻1 h，12 000 r/min，離心5 min，抽取上清液，即為組織總蛋白，用BCA蛋白檢測法進行蛋白定量。取50 μg蛋白，調整體積為24 μL，樣品煮沸5 min，6 000 r/min，離心5 min，經SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法將蛋白轉移至NC膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，1∶200稀釋的IL-10一抗,4 ℃孵育過夜；TBST洗3次，每次5 min；1∶1 000稀釋的二抗，室溫孵育l h，TBST洗3次，每次10 min；用ECL發光劑室溫孵育l min，化學發光成像系統照相，體積法測定各條帶的光密度值。同樣方法測定β-actin的光密度值,各條帶IL-10與相應β-actin的光密度值比值為該條帶的相對光密度值。各組取3只小鼠的樣本，重復試驗3次,每次以模型組條帶相對光密度值為1進行數據標準化，所得9次數據進行統計學分析。

3 結果

3.1 HIS對S180肉瘤小鼠瘤重、抑瘤率及脾指數的影響 見表1。

表1 HIS對S180肉瘤小鼠瘤重、抑瘤率及脾指數的影響(±s,n=10)

3.2 HIS對S180肉瘤小鼠血清IL-6水平的影響 見圖1。

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與腫瘤模型組比較，△△P<0.01；與CTX組比較，▲▲P<0.01。

3.3 HIS對S180肉瘤小鼠腫瘤組織細胞因子IL-10表達的影響 見圖2。

注：與腫瘤模型組比較，##P<0.01；與CTX組比較，△△P<0.01。

4 討論

本實驗結果表明,HIS可明顯抑制S180肉瘤的生長，同時小鼠的脾指數升高，提示HIS可通過提高機體的免疫功能起到抗腫瘤作用。

免疫機制的失能是腫瘤形成的重要因素。其中Th1/Th2細胞的平衡向Th2細胞漂移是腫瘤免疫機制失能的主要表現之一。Thl類細胞分泌IL-2、INF-γ和TNF-β等細胞因子，是機體抗癌、抗病毒的主要參與者；Th2類細胞分泌IL-4、IL-6和IL-l0等細胞因子,在體內可抑制免疫應答[4]。而腫瘤宿主處于Th2細胞因子優勢狀態是腫瘤免疫逃逸的機理之一。IL-6是一種多效應的細胞因子，也是重要的免疫抑制因子[5]，主要由淋巴細胞、激活的巨噬細胞和血管內皮細胞產生。IL-6與多種腫瘤發生、發展關系密切,它通過干預細胞的黏附性、血栓形成、腫瘤特異性抗原的表達及腫瘤細胞的增值從而影響腫瘤的進展[6]。IL-10作為重要的免疫抗炎因子,也被稱為人類細胞因子合成抑制因子。它能抑制T細胞的增殖分化，抑制單核細胞和自然殺傷細胞的生物活性，抑制Th1細胞產生IL-2、INF-γ等,從而下調機體的抗腫瘤反應[7-9]。實驗結果表明，HIS可明顯降低小鼠外周血IL-6水平，降低腫瘤組織中IL-10表達。提示HIS可抑制腫瘤形成過程中Th1/Th2細胞的平衡向Th2細胞漂移，減輕腫瘤機體的免疫機制的失能，從而有效抑制腫瘤的生長。

綜上所述，HIS可提高機體免疫功能并有抑瘤效果。作用機理可能與HIS降低了免疫抑制因子IL-6、IL-10表達水平，抑制Th1/Th2細胞平衡向Th2細胞漂移有關。從而為進一步在臨床推廣和使用HIS提供了理論依據。

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