RNAi在成體干細胞分化的研究進展

項 煒，安榮澤，王兆杰 [遵義醫學院第五附屬（珠海）醫院骨外科，廣東 珠海 519000]

RNAi（RNA interference）是普遍存在于自然界中的基因沉默現象，是近些年才發現并迅速發展起來的一門新興的基因阻斷技術，RNAi是一種強有效的抑制基因表達的工具，以高度特異性、高效性、作用迅速以及操作簡單等特點受到分子生物學研究者們青睞，該技術由Andrew Fire和Craig Mello在秀麗新小桿線蟲中發現，已廣泛應用于基因功能的研究、抗腫瘤以及各種疾病的研究中[1]。

1 成體干細胞

成體干細胞是一種具有自我更新、不斷增殖和組織特異性定向分化潛能的一類細胞，曾認為其再生和分化潛能是比較局限的，然而當成體干細胞的“可塑性”被提出后，這種潛能低的觀點受到抨擊。Blau表明擴展成體干細胞的傳統概念是必要的，他們提出成體干細胞的新概念，認為成體干細胞存在于不同類型的組織中，是一種細胞狀態，而且可以通過血液循環到達機體各處，參與組織的修復和再生[2]。目前發現的成體干細胞主要有造血干細胞、神經干細胞和間充質干細胞。另外還有肝臟干細胞，毛囊來源性干細胞、牙髓干細胞等[3-4]。

2 RNAi在成體干細胞中的應用

近些年，RNAi高效、特異的基因沉默作用，激發了科研工作者們對其應用前景的探索。目前該技術在細胞水平上的研究已取得了巨大成功，在成體干細胞方面也有許多成功的試驗。Low等指出在生物醫學中，引導或促進干細胞分化方面，RNAi是一種重要技術手段[5]。

3 RNAi在造血干細胞中的應用

造血干細胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）是造血細胞的“種子”，體內所有的血細胞都由它分化而來。存在于骨髓外周血臍帶血中，可以轉變成肝細胞、神經細胞，或在肌肉組織中分化為有成熟肌肉細胞表型的細胞等，還可隨血液流動進入全身各個組織中補充各種組織中成體細胞的不足，HSCs又是一個基因治療的理想靶細胞[6]。

隨著HSCs分離、純化和體外培養技術的日趨成熟，以HSCs為靶細胞的基因轉移已成為基因功能研究的一個重要領域。Gupta構建了以病毒為載體，帶有綠色熒光蛋白（GFP），用以沉默人腎母細胞過度表達基因序列（Nephroblastoma Overexpressed，Nov/CCN3）的短發夾RNA（shRNA），在轉染至HSCs后第7天，通過RT-PCR檢測發現Nov/CCN3表達明顯減少，HSCs在體內外的功能均喪失[7]；然而，加強Nov/CCN3基因表達卻可增強HSCs增值分化的活性，以此實驗證明了Nov/CCN3基因是HSCs增值分化關鍵的調節基因。為了提高HSCs的細胞轉染率，許多學者在載體方面做研究，Papadaki首次以泡沫病毒（Foamy virus，FV）為載體，將帶有小鼠mU6和人類H1聚合酶Ⅲ啟動子的序列在體外分別轉染到人和小鼠的HSCs中，經骨髓移植至小鼠體內進行觀察，兩者均十分有效地沉默了目的基因，并表明FV作為載體在HSCs中高轉染率及其高度穩定性[8]。Martino實驗表明，HSCs在定向分化成樹突狀細胞時，運用RNAi技術，通過陽離子脂質體DOTAP轉染法沉默組織蛋白酶S基因（Cathepsin S，CatS），可影響HSCs成樹突狀細胞的轉化，而且具有轉染率高，毒性比病毒載體低的優點[9]。

4 RNAi在神經干細胞中的應用

神經干細胞（Neural Stem Cells，NSCs）是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細胞，它可以通過不對等的分裂方式產生神經組織的各類細胞，NSCs的發現打破了神經元不會再生的傳統觀念。近年來人們對多種神經系統疾病的相關基因基礎有了新的認識，NSCs的臨床應用與基因治療的有機結合，為多種神經系統遺傳性和獲得性疾病的治療開辟了一條嶄新的途徑[10]。

NSCs可在體外培養且根據不同需要導入外源基因，是一種廣譜的細胞載體，細胞的轉染均存在轉染率的問題，而干細胞更是比較難轉染的細胞之一，構建高轉染率載體是必要的，張蓬勃構建針對小鼠低氧誘導因子-1α基因（HIF-1α）的siRNA腺病毒載體AdHIF-1α-shRNA-EGFP，體外轉染培養的小鼠前腦皮質NSCs，實驗證明腺病毒載體能較高效率地轉染小鼠胚胎NSCs并能有效抑制低氧條件下HIF-1α的表達[11]。學者們以RNAi技術基因沉默NSCs的相關基因，觀察基因沉默后對NSCs分化方面的影響也進行了研究。王東等在顱腦損傷的研究中表明，通過RNAi技術，暫時性封閉NSCs中的NgR基因，再通過立體定向的方法準確移植到大鼠顱腦損傷區，移植的NSCs可以更好的在損傷部位存活，增殖分化與遷移，促進腦外傷后大鼠神經功能的恢復[12]。有學者發現，通過構建siRNA沉默NSCs中的RE1沉默轉錄因子（REST），調整REST水平，不僅可以控制NSCs的分化，而且可以使得一些涉及復雜分子機制的神經細胞功能被激活，如神經軸突的生長等[5]。

5 RNAi在間充質干細胞中的應用

間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層。MSCs最早在骨髓中發現，隨后還發現存在于人體發生、發育過程的許多種組織中。目前，我們能夠從骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍帶血中分離和制備間充質干細胞。

RNAi技術應用于MSCs的相關研究較多。Suehiro等利用相關的siRNA分別沉默MSCs中的ZHX3，RUNX2和Osterix基因，對比三者間影響MSCs的成骨能力，實驗表明ZHX3基因在MSCs成骨細胞分化能力可與RUNX2和Osterix基因相媲美，以此推斷ZHX3是MSCs成骨分化的關鍵因子[13]。有研究顯示，通過脂質體法將PTEN基因特異的siRNA轉染入骨髓來源的間充質干細胞（BMSCs），PTEN基因的沉默能有效地促進BMSCs的增殖，使細胞周期向右偏移，同時能抑制細胞凋亡，增強細胞對缺血缺氧的耐受能力[14]。體內實驗也證實，PTEN基因沉默后的BMSCs更容易在心肌梗死區域存活和增殖，為干細胞移植治療心肌梗死提供新的思路。我國在胎盤和臍帶來源的MSCs方面研究在世界上處于前列，陳奎通過RNAi技術下調人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs）中HLA-A2基因表達，可能是RNAi的高特異性和靶序列的選擇性，siRNA只特異地沉默了其相應靶基因的表達，發現HLA-A2基因的沉默并不影響hUCMSCs成骨細胞的分化[15]。

6 展望

成體干細胞在特定的環境或誘導作用下分化產生新的目的細胞，不存在道德問題，將成為醫學研究中首選的種子細胞，但成體干細胞向多種組織分化用于治療的路程可能還很漫長，而RNAi技術具有巨大的應用前景，通過成體干細胞和RNAi技術兩者的相結合，研究決定細胞發育特定基因的功能，通過沉默目的基因，進行細胞干預和基因調控，可暫時性抑制細胞內某段基因而不是永久敲除，為成體干細胞研究的可操作性提供一個完美的技術手段。利用RNAi技術特異性抑制成體干細胞維持或定向分化研究，對進行疾病治療具有重要的現實意義。

目前，RNAi和成體干細胞研究尚處于初級階段，但兩者的結合已顯示出巨大的應用潛力。總之，RNAi的應用將為成體干細胞研究開辟一條全新的途徑。

[1] Mello CC,Conte DJ.Revealing the world of RNA interference[J].Nature,2004,431(7006):338.

[2] Blau HM,Brazelton TR,Weimann JM.The evolving concept of a stem cell:entity or function[J].Cell,2001,105(7):829.

[3] Snippert HJ,Clevers H.Tracking adult stem cells[J].EMBO Rep,2011,12(2):113.

[4] Hodgkinson T,Yuan XF,Bayat A.Adult stem cells in tissue engineering[J].Expert Rev Med Devices,2009,6(6):621.

[5] Low WC,Yau WW,Stanton LW,et al.Directing neuronal differentiation of primary neural progenitor cells by gene knockdown approach[J].DNA Cell Biol,2012,31(7):1148.

[6] 李玉艷,梁志清,史常旭.造血干細胞基因轉染研究進展[J].國際檢驗醫學雜志,2009,30(4):355.

[7] Gupta R,Hong D,Iborra F,et al.NOV(CCN3)functions as a regulator of human hematopoietic stem or progenitor cells[J].Science,2007,316(5824):590.

[8] Papadaki M,Siapati EK,Vassilopoulos G.A foamy virus vector system for stable and efficient RNAi expression in mammalian cells[J].Hum Gene Ther,2011,22(10):1293.

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[13] Suehiro F,Nishimura M,Kawamoto T,et al.Impact of zinc fi ngers and homeoboxes 3 on the regulation of mesenchymal stem cell osteogenic differentiation[J].Stem Cells Dev,2011,20(9):1539.

[14] 雷 瑩,陳 杭,許 紅,等.PTEN基因的沉默對骨髓間充質干細胞體外生物學特性和體內移植治療心肌梗死的影響[J].臨床心血管病雜志,2011,27(4):307.

[15] 陳 奎,秦書儉.siRNA沉默HLA-A2基因表達對人臍帶間充質干細胞誘導成骨的影響[J].解剖科學進展,2010,16(5):413.