人源性治療性抗體的應用與制備進展

郭夕源，楊江華綜述，鄔于川，袁青審校

（1.瀘州醫學院免疫學教研室，四川瀘州646000；2.瀘州醫學院附屬口腔醫院，四川瀘州646000）

·綜述·

人源性治療性抗體的應用與制備進展

郭夕源1，楊江華2綜述，鄔于川1，袁青1審校

（1.瀘州醫學院免疫學教研室，四川瀘州646000；2.瀘州醫學院附屬口腔醫院，四川瀘州646000）

治療性抗體在疾病的診斷和治療方面具有重要意義。鼠源性單克隆抗體的臨床應用受限于誘導產生人抗鼠抗體、親和力低和半衰期短等，隨著轉基因小鼠和噬菌體展示技術的成熟，人源性治療性抗體飛速發展，在腫瘤治療、自身免疫性疾病的治療、感染性疾病的治療及減輕移植排斥反應、體內定位診斷、免疫調節等方面發揮重要作用。本文綜述了治療性抗體在腫瘤及免疫、移植等疾病中的治療應用及人源性治療性抗體的制備。

單克隆抗體；治療性抗體；人源性

抗體(Antibody)具有多種生物學效應，其在疾病的診斷和治療方面具有重要意義，尤其在疾病治療方面巨大的應用前景，已經引起人們越來越多的關注。由于單克隆抗體[1]具有性質純、效價高、特異性強、少或無血清交叉反應等特點，已被廣泛應用于醫學和生物學各領域，如腫瘤治療、自身免疫性疾病的治療、感染性疾病的治療及減輕移植排斥反應、體內定位診斷、免疫調節等，這類抗體被統稱為治療性抗體。治療性抗體的發展經歷了曲折的百年歷史。早在19世紀末，人們就發現抗血清能中和細菌毒素，于是用免疫動物的血清預防和治療某些感染性疾病。從此，人們對治療性抗體產生了濃厚的興趣，但由于早期治療效果不佳及嚴重的副作用，使得抗體治療一直沒有得到理想的效果。直到1975年Kohler和Milstein應用雜交瘤技術制備了鼠單克隆抗體，為人類樹起了抗體研究領域的第一個里程碑。1982年，Levy等制備了針對一位B淋巴細胞瘤患者瘤細胞的獨特性單抗，患者經此抗體治療后，病情緩解，瘤體消失。1986年，Ortho開發了世界上首個用于治療腎臟移植后的排斥反應的單抗藥物：抗CD3單克隆抗體OKT3，該藥獲得了食品藥物管理局(FDA)批準。1995年，用于治療大腸癌的l7-1鼠單抗在歐洲上市。1997年FDA批準第一株人源化抗體上市。2002年，阿達利單抗(Adalimumab)成為第一個被美國FDA批準的治療性人源單抗，隨后一批人源抗體相繼被開發[2-3]。1986-2012年，美國FDA或歐洲已批準了34個治療性抗體上市。2012年3月，我國第一個治療性人源化單克隆抗體尼妥珠單抗[4]臨床應用研討會在古巴舉行。

1 治療性抗體的應用

抗體既可作為受體的拮抗劑或抑制劑，起到中和毒素或阻斷細胞因子對細胞的殺傷作用，也可利用其他的生物學效應，如抗體介導的細胞依賴性細胞毒作用(ADCC)和補體介導的細胞毒作用(CDCC)效應而發揮作用。另外抗體還可以作為靶向分子通過與放射性元素、化學藥物及生物毒素分子耦聯，通過靶向治療發揮細胞毒作用。

自從首次發現單克隆抗體在醫學可能存在的應用價值后，它們已被廣泛地應用于診斷中，對其用于治療的可能性研究正以指數級的速度推進。由1985-2008年進入臨床研究的人類單克隆抗體的累計數[5]分析，人類單克隆抗體在臨床應用中的研究快速增長，用于抗腫瘤和免疫調節的人類單克隆抗體開發率特別高。截止2011年，美國FDA批準的治療性抗體廣泛應用于治療腫瘤、類風濕性關節炎、克羅恩病、抑制移植排斥反應、抗病毒預防等。

1.1 治療性抗體在抗腫瘤方面的應用惡性腫瘤在臨床上很難治愈。在手術、放療和化療不能取得最佳療效的情況下，抗體被認為是治療腫瘤的重要輔助手段。腫瘤治療性抗體包括抗體、裸抗體和修飾的抗體。裸抗體主要通過ADCC效應聚集和活化宿主的效應細胞、通過CDCC效應、阻斷受體-配體的相互作用以及誘導細胞凋亡等機制殺傷腫瘤細胞。修飾的抗體中部分抗體自身并不能殺傷腫瘤細胞，但可以運載放射性同位素、毒素、藥物、酶等至腫瘤局部。將細胞毒性物質特異靶向于腫瘤細胞，使腫瘤局部達到高濃度，減輕全身應用帶來的副作用及由此導致的劑量限制。腫瘤治療性抗體與傳統的生物藥物和化療藥物相比，具有良好的靶向、可以誘導機體自身產生針對疾病的抵抗力、療效好、毒副作用低，而且可以反復給藥。現已批準上市的治療性抗體中腫瘤治療性抗體占35.48%，包括用于治療淋巴瘤的單抗Rituximab、Tositumomab、Ibritumomab。治療白血病的單抗Gemtuzumab、Alemtuzumab、Ofatumumab[6]；治療乳腺癌的單抗Trastuzumab，治療大腸癌的單抗Cetuximab、Bevacizu-mab、Panitumumab[7]和治療黑色素瘤的單Ipilimumab[8]。其中Ibritumomab適用于治療復發或難治性低度、濾泡性以及轉移性B細胞非霍奇金淋巴瘤，是第一個腫瘤放免治療劑；結直腸癌治療藥Panitumumab與表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)具有高親和性，現已用于治療實體腫瘤進入臨床試驗階段，這也是第一個完全人源性的單克隆抗體。尼妥珠單抗Nimotuzumab可特異性封閉EGFR[4，9]，使腫瘤細胞對電離輻射敏感，因其提高放療敏感性而提高放療效果。

1.2 治療性抗體在自身免疫性疾病中的應用治療性抗體在多種自身免疫性疾病的治療中取得了許多研究成果。這些抗體主要包括細胞因子特異性抗體和淋巴細胞特異性抗體。該抗體可與細胞因子特異性結合，切斷信號通路，從而起到阻斷細胞因子對細胞的殺傷作用。已批準的治療性抗體中治療自身免疫性疾病的抗體占32.26%，包括治療克羅恩病的單抗Infliximab和Certolizumab；治療類風濕性關節炎的單抗Adalimumab、Golimumab和Tocilizumab；治療銀屑病的單抗Efalizumab和Ustekinumab；治療哮喘的單抗Omalizumab[10]；治療多發性硬化癥的單抗Natalizumab；通過噬菌體展示技術與劍橋抗體技術所識別的針對B-淋巴細胞刺激因子的治療系統性紅斑狼瘡的人源性單抗Belimumab[11]。其中Infliximab的治療適應證不僅局限于克羅恩病，還包括類風濕關節炎、強直性脊柱炎、銀屑病性關節炎等自身免疫性疾病；Uste-kinumab被批準用于治療中度至重度斑塊型銀屑病，并已證明在克羅恩病和銀屑病關節炎的療效[12]。其在研究細胞表面標志、提純可溶性抗原、進一步研究抗體的結構和功能等方面都起著十分重要的作用；Omalizumab能抑制免疫球蛋白IgE與高親和性IgE受體在肥大細胞和嗜堿細胞表面結合，從而阻止過敏反應介質的釋放、發展成治療嚴重哮喘的重要選項[13]。Belimumab經過多年研究在2011年3月被FDA批準用于治療狼瘡，這是FDA在56年來第一個批準的狼瘡治療新藥。

1.3 治療性抗體在感染性疾病和其他疾病中的應用抗體治療微生物感染可以通過多種機制發揮作用，如阻止微生物粘附、聚集、中和病毒、中和毒素等，也可以通過抗體的效應功能如ADCC或CDCC效應發揮作用。抗體既可以直接作用于病原體本身，也可以中和其產生的毒性物質，還可以增強宿主細胞的效應功能。治療性抗體對細菌感染的治療主要針對臨床的常見耐藥菌株，如金黃色葡萄球菌等。對一些病毒性疾病效果較好，如抗人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒感染、炭疽桿菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒及膿血癥等方面。另外，治療性抗體在其他疾病中也有所應用，如防止血塊形成的單抗Abciximab、治療惡性腹水的單抗Catu-maxomab[14]、治療陣發性睡眠性血紅蛋白尿的單抗Eculizumab、防骨質流失的單抗Denosumab等。

2 全人源治療性抗體的制備

在臨床應用早期，OKT3和l7-1這兩種鼠源性單克隆抗體均引起了由于產生人抗鼠抗體(Human anti-mouse anti-body，HAMA)而導致的不良反應。20世紀90年代初，抗內毒素單抗在用于治療膿毒癥時，不僅沒有取得預期的效果，反而增加了患者的死亡率。這使人們認識到鼠單抗藥物在人體治療中存在諸多問題。鼠源性的單抗由于存在異源性在人體內可誘導HAMA產生，而且鼠單抗不能有效地激活人體的生物效應，加之在人體內的半衰期短，從而限制了其應用。

1997年后，人源化抗體陸續上市。近年批準上市的抗體幾乎都是基因工程重組嵌合、人源化或全人源性抗體。人源化抗體較好地保留了親本抗體的特征，在人體的半衰期和效應功能也更加接近于人抗體。但由于其仍至少具有10%的異源蛋白，仍舊具有免疫原性[15]，在臨床應用中還是受到不同程度的限制，據報道，已上市的嵌合抗體或人源化抗體仍然存在人抗嵌合抗體(Human anti-chimeric antibody，HACA)或人抗人抗體(Human anti-human antibody，HAHA)[16-17]。為徹底解決抗體的免疫原性問題，目前人們更多將目光轉向發展全人源性抗體。

隨著基因工程抗體時代的到來，多聚酶鏈式反應(PCR)技術的發展、大腸桿菌內分泌有結合功能的免疫球蛋白分子片段的成功獲得和噬菌體抗體庫技術的產生使全人源性抗體的產生得以實現。2002年，第一個全人源性抗體Humira上市。全人源性抗體可以通過多種技術來制備，目前使用最多的制備技術主要是轉基因小鼠技術和抗體庫技術。

2.1 轉基因小鼠技術1989年，Bruggemann等成功將人抗體重鏈基因庫轉入小鼠，使小鼠產生了人重鏈蛋白的免疫應答。隨后，轉基因小鼠技術不斷發展完善。1994年，美國轉基因小鼠作為生產全人抗體的載體問世。1997年Abgenix公司使用該技術成功地制備了轉基因小鼠Xenomouse，這種Xenomouse是一種經過遺傳工程變異的小鼠，其體內能夠合成具有人類蛋白質序列的抗體。Medarex公司建立的轉基因鼠稱為HuMAb-Mouse，其所研制的抗體已進入Ⅲ期臨床試驗階段[18]。轉基因小鼠技術用于制備全人源性抗體時，由于抗體是體內產生，經歷正常裝配和成熟過程，所以具有功效高、靶親和力強的優點。但也存在一些缺陷，除了操作復雜、難度高、費用巨大以及產生不完全的人序列外，英國學者Clark認為，由于在小鼠體內完成抗體的裝配和糖基化的最后步驟，所以產生的抗體可能會具有鼠糖基化的模式。雖然目前尚無臨床證據表明，鼠糖基化會引起任何問題，但是直接導致這些單克隆抗體最終并不是全人源性的。

2.2 噬菌體抗體庫技術20世紀90年代，組合化學技術與基因工程抗體技術相互結合產生了抗體庫技術。抗體庫技術的產生使人們改變了傳統的抗體制備方法，開辟了體外制備抗體的新天地，目前被認為是制備人源性抗體的最快速、簡單和經濟的方法。抗體庫最大的特點是除了可以進行高通量篩選和所篩選到的抗體是人源性抗體外，還在于它的庫容量可以達到109～1013，理論上可以從這些大容量人抗體庫中篩選到針對任何抗原的特異性抗體[19]，解決了一些針對弱免疫原、毒性抗原的難制備抗體的問題。噬茵體抗體庫根據抗體基因序列的來源，可分為天然抗體庫、免疫抗體庫、半合成抗體庫、合成抗體庫四類。抗體庫技術具有強大的篩選功能，利用噬菌體抗體庫可以直接從庫中篩選針對某一抗原的特異性抗體。以噬菌體抗體與抗原的結合為基礎，通過多輪“吸附一洗滌一洗脫一擴增”過程，可使特異的噬菌體得到上千倍乃至109的富集。傳統篩選方法可分為固相淘篩法和液相篩選法；新近一些篩選方法如完整細胞篩選法、組織或體內篩選法、選擇感染法、高通量篩選法等[20-21]。針對不同抗原，其最佳篩選方法的選擇也不相同。根據各篩選方法不同的特點，可選用兩種進行交替篩選來提高篩選陽性率。但若要從天然抗體文庫中篩選到專一針對各種抗原的抗體，那么文庫容量需足夠大，至少要大于109[22]。縱觀近年研究報道，所構建的大多數人源抗體文庫所用的淋巴細胞RNA來源比較單一，一般來自健康志愿者或針對某種疾病構建抗體文庫，以至于抗體文庫的多樣性受到一定的局限[23-24]。近些年有許多其他展示平臺系統也被用來進行抗體庫的展示，包括核糖體展示、酵母展示、細菌展示、桿狀病毒展示、哺乳細胞展示、反轉錄病毒展示以及細菌周質展示，還有最小單位的展示系統，如mRNA展示、DNA展示系統等等。核糖體展示技術使展示技術擺脫了體內展示技術對轉化效率的限制，庫容量大大提高，為體外高通量的篩選奠定了技術；mRNA展示技術直接將mRNA同表達的蛋白質連結，使篩選的效率進一步提高；DNA展示技術DNA模板取代不穩定的mRNA使展示系統更加的穩定，方法簡便巧妙。三種技術已在抗體的篩選、親和力成熟、分子進化方面廣泛的應用。上述一些體外展示技術不依賴于任何細胞體系，不受克隆和細胞轉化效率的影響，庫容量大，可達1013～1015，可彌補傳統的體內展示技術的不足。

3 展望

人源性單克隆抗體是一類快速增長的有前途的定向治療藥物[25]。隨著科技的進步，在20世紀90年代，人類對分子層面的研究深入，尤其是轉基因小鼠和酵母或噬菌體展示技術，重建了在人類單克隆抗體的發展的興趣。治療性抗體是進入臨床研究中增長最快的類別，其本著制備便捷、高靶點特異性、療效好、毒副作用小、應用范圍廣、開發空間闊的優勢保持重要的地位和迅猛的發展勢頭。由于在臨床使用上獨特的優勢和各種相關技術的日益成熟，在過去的10年里，上市的單克隆抗體成倍地增長[26]，但是單克隆抗體藥物還面臨一些問題，主要涉及免疫學和藥理學兩方面。免疫學方面，鼠源性的單抗可能被宿主的免疫系統攻擊，產生人抗鼠抗體(HAMA)反應，嵌合性抗體和人源化抗體雖可解決鼠源化問題但是也會產生人抗嵌合抗體(HACA)或人抗人抗體(HAHA)。此外，腫瘤細胞群體在抗原性方面的異質性，腫瘤細胞的抗原性調變等也可能影響耦聯物的療效。藥理學方面的問題主要是由于耦聯物是異體蛋白，會被網狀內皮系統攝取，有相當數量將積聚于肝、脾和骨髓，因而細胞劑量不足。大分子的耦聯物通過毛細血管內皮層及穿透腫瘤細胞外間隙均受到限制。今后人們將致力于解決這兩方面的問題。從已上市的抗體藥物看，未來治療性抗體將朝著全人源化、微型化、規模化及智能化方向發展。但全人源性抗體是否能解決非人源聚糖具有潛在的免疫原性所引起的效價降低及給患者帶來的嚴重后果，還有待于臨床檢驗。隨著生產單抗的新方法不斷出現，人們將開發出各種性能優良抗體、多功能抗體融合蛋白及抗體替代物，抗體類藥物的療效將大大提高。

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1003—6350(2013)01—0107—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.01.0050

2012-09-11)

國家自然科學基金（編號：31000415）；四川省衛生廳資助項目（編號：80167）；四川省青年基金（編號：2012JQ0018）

鄔于川。E-mail：wuyu6807@tom.com