肝癌石蠟標本免疫組化染色常見問題及對策*

林麗琳，翁劍武，張心妤，王 鳳，黃秀清，謝 群

(莆田學院醫學院，福建莆田 351100)

技術方法

肝癌石蠟標本免疫組化染色常見問題及對策*

林麗琳，翁劍武，張心妤，王 鳳，黃秀清，謝 群△

(莆田學院醫學院，福建莆田 351100)

肝細胞癌;免疫組織化學;內源性生物素;抗原修復;石蠟標本

1 切片技術

1.1 存在問題 臨床上HCC石蠟標本在鏡下常可見肝癌組織、肝組織纖維化、脂肪變性、正常肝組織等表現。因此，HCC組織切片形態多樣、結構復雜，組織質地不一。通常表現較為堅硬，導致切片難度較大，切片易出現裂縫、缺口、皺褶等，給切片帶來一定難度。

1.2 解決辦法

1.2.1 蠟塊預冷:將石蠟包埋組織塊預先放入-20℃冰凍30min左右，時間應適度，時間過長會使蠟塊出現龜裂，冰凍過短則整個蠟塊致冷不均勻、不充分，會出現切片不平整;切片過程中若組織塊溫度回升，應及時用冰塊冷敷1-2min，并用拇指蘸冰水撫平組織塊;夏季室溫高則輔以空調降低室溫。這些措施均可有效保證切出平整的切片。

1.2.2 修片和切片:刀片鈍、有缺口可致切片出現裂縫等，修片過程中建議使用刀片固定的一個位置專門修片，修片后切片時應換到修片位置相鄰的部位，這樣讓切片在未修片位置的鋒利刀口處進行，保證切片平整，同時還可以減少刀片的損耗。我院實驗室切片中發現HCC中癌變合并脂肪肝病變時組織切片極易損耗刀片，切片時應及時更換新刀片，可避免因刀片原因導致的切片裂痕等現象。在切片過程中要注意用力均勻，避免切片厚薄不均。

2 抗原修復

2.1 存在問題 不同肝癌細胞抗原在細胞中的定位存在差異，抗原修復的難易程度不一。實驗中會出現三種情況:一是肝癌細胞抗原修復無法使抗原充分暴露，出現假陰性結果(圖1A);二是抗原修復可以暴露抗原，也可使原被甲醛封閉的內源性生物素活化，出現假陽性結果。本實驗室在采用EDTA(pH=9.0)，SP法時就出現過明顯的假陽性結果(圖1B)，胞質中可見均勻的棕色顆粒，與李雯等的報道一致[2];三是肝癌組織采用雙修復法，即檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)高溫高壓修復法加胰蛋白酶修復法，導致消化處理過度，組織結構破壞(圖1C)。

圖1 HCC抗原修復不良的三種后果

2.2 解決辦法

2.2.1 抗原修復方法的選擇:如果已知抗原定位，可以先了解常用的抗原修復方法，以提高預實驗的陽性率。一般來說，胞膜抗原建議微波加熱修復法;胞核抗原修復難度較大，幾乎都需要高溫高壓修復，修復液應選擇檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)[3]。EDTA(pH=8.0/9.0)適合于大多數抗原修復，特別是對于定位于胞核和較難表達的抗原效果較好[4-5]。胰蛋白酶主要用于修復定位于胞內的抗原，胃蛋白酶消化力較前者強，主要用于修復細胞間質抗原[6]。

2.2.2 阻斷內源性生物素:肝組織含有較豐富內源性生物素，加熱抗原修復活化后可與卵白素或鏈酶卵白素結合，因而基于(鏈菌)抗生物素蛋白檢測系統的免疫組織化學方法(如SP法)易出現假陽性[7]。因此，可通過使用外源性抗生物素蛋白阻斷內源性生物素來消除其影響，或使用非生物素監測系統。

2.2.3 條件控制:肝癌組織使用酶修復法應注意37℃孵育的時間，一般為15min，可根據免疫組化染色鏡下觀察，并與HE的組織形態比較，判斷是否過度消化組織。若發現組織結構破壞，薄且較透明，染色較淺時，可以考慮縮短酶孵育時間。

3 非特異性染色情況的分析與對策

①肝組織含有膽色素可影響免疫組化染色[8]。而肝組織中的Kupffer細胞和肝癌細胞可能會吞噬抗原等異物，應注意鑒別判斷。建議通過陰性對照片和HE染色鑒別。②肝內有豐富的肝血竇，貯藏大量的血液，因此，肝癌組織易發生出血、壞死，細胞自溶釋放出各種蛋白或多肽片斷與抗體發生非特異染色，嚴重壞死的肝癌組織染色后呈均勻黃染(圖2)。建議盡量選用壞死、出血情況輕微的肝癌組織[9-11]。

4 假陽性原因分析與對策

4.1 原因分析 生物素是參與糖異生和脂肪酸合成反應的輔酶之一，產生的主要部位是腸道。人體內主要分布于細胞質和線粒體中，故代謝旺盛、線粒體豐富的細胞中生物素含量高，如肝臟、腎臟、乳腺、結腸組織，廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織等[7,12]。目前的研究發現，內源性生物素位于細胞胞漿中，呈現均勻的顆粒狀染色(圖3)。腫瘤細胞中含有豐富的線粒體，故內源性生物素含量很高。在同一組織器官不同類型的腫瘤中，內源性生物素表達水平可能會有差異[13-15]。

有文獻報道，內源性生物素在正常肝組織、肝硬化組織及肝癌組織中都有分布,主要以顆粒狀形式存在于胞質中,容易造成非特異性顯色[16]。而各種肝臟病變對肝臟代謝能力的影響有所不同，肝癌組織不同切片所含內源性生物素存在差異，不同層次的組織切片相距愈遠，組織形態差異愈大，組織表達生物素水平差異也愈大。原來被甲醛等固定液封閉的內源性生物素經加熱抗原修復重新暴露出來，可使(鏈菌) 抗生物素蛋白檢測系統的免疫組織化學方法(如SP、SABC和LSAB法)出現假陽性結果，勢必影響結果判定[7,12]。

圖3 肝癌組織內源性生物素表達強陽性(SP法)

4.2 對策 ①蛋清封閉法[7,12]:使用新鮮蛋清稀釋成15%-30%蛋清液，在一抗孵育后室溫孵育30min，封閉效果有較高的濃度依賴性，需經過預實驗確定適合的濃度。封閉前后應用蒸餾水充分洗滌,PBS漂洗3次×3min，防止產生非特異染色。內源性生物素先與蛋清液中含有抗生物素的蛋白結合，封閉了內源性生物素樣分子的結合位點，避免了內源性生物素與SP、SABC、LSAB檢測系統中抗生物素蛋白或鏈菌抗生物素蛋白的結合,從而消除內源性生物素的非特異性干擾。經過合適的閉后使用生物素標記的系統可以取得理想結果，該檢測系統可作為首選方法之一[12]。②生物素阻斷系統[10]:使用卵白素進行封閉，但研究表明有的封閉液不能達到滿意的封閉效果[12]。③非生物素檢測系統Polymer兩步法[11,17]:如Envision、EliVision檢測系統能有效避免內源性生物素的干擾。④嚴格制備陰性對照片。以上方法都應堅持使用陰性對照，而且建議采用連續切片，切片組織形態相近，有較高的可比性。

5 假陰性分析與對策[18]

5.1 抗原丟失 一般切片室溫保存3-6月后會出現不同程度的抗原丟失。對于已切好的石蠟切片貯藏時間不應太長且應做好時間記錄，在有效時間內進行試驗，對于可疑抗原丟失的，可用石蠟切片(新鮮切片)來驗證。

5.2 抗原修復 修復不全或無效，抗原決定簇暴露不全。進行有效的抗原修復,EDTA(pH=8.0/9.0)適合于大多數抗原修復，特別對于定位于胞核和較難表達的抗原效果較好。

5.3 抗體與組織結合 內源性過氧化氫酶阻斷劑可能會影響抗體與組織的結合。阻斷內源性過氧化氫酶是使用3%過氧化氫與內源性過氧化氫酶反應，防止內源性過氧化氫酶催化底物，使DAB顯色。而正確的反應是DAB與連接在抗原抗體上過氧化氫酶反應，定位在細胞抗原部位。內源性過氧化氫酶阻斷步驟應放在DAB顯色之前操作，在其它可能問題都排除的情況下，可以考慮將此步驟放在一抗孵育后。

綜上所述，癌組織的免疫組化染色在HCC診斷中的作用愈來愈重要，同時關于HCC發病機理與轉移機制的研究也是熱點之一，免疫組化染色在醫學科研中的使用率也是居高不下。因此，臨床診斷人員與科研工作者應當認識到HCC免疫組化染色的重要性，控制好實驗條件，嚴格要求每個實驗步驟，預防和糾正實驗中可能出現的問題，重視每個導致實驗結果失真的因素，謹慎分析免疫組化結果，避免出現假陽性和假陰性結果，從而提高病理診斷與科學研究的準確率，為HCC防治提供正確的指導。

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R-331

A

1004-6879(2013)06-0506-03肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)約占原發性肝癌的90%，在全球范圍發病率居惡性腫瘤第5位，死亡率居第3位，在我國僅次于肺癌和胃癌[1]。免疫組織化學技術是HCC臨床病理診斷中最重要的技術手段之一，且廣泛應用于HCC科學研究領域。然而，由于HCC標本病理學形態多樣化、病變組織質地較硬及富含內源性生物素等因素，導致在實驗操作中特異性染色不佳，假陽性及假陰性等現象頻發，大大影響了臨床診斷與科研檢測。本實驗室在實踐中發現，選擇正確合理的抗原修復方法以及排除非特異染色是極其重要的環節。

2013-05-28)

* 福建省教育廳資助省屬高校科研專項(JK類)項目(JK2011050)

△ 通訊作者