山楂葉總黃酮對大鼠慢性腦缺血時星形膠質細胞GFAP表達的影響

封獻敬，曹娜娜，檀榮方，許 麗，武世超，吳曉光

(1.承德醫學院臨床醫學系2011級，河北承德 067000;2.指導老師)

中樞神經系統主要由神經元和神經膠質細胞組成，其中星形膠質細胞數量最多，約占膠質細胞總數的70%。它不僅對神經元起支持、保護和營養作用，更能促進神經元的生長，提高神經元興奮活性。但當慢性腦缺血時，星形膠質細胞過度反應性增生，可產生多種細胞因子和炎性介質，并可通過釋放細胞毒性物質和炎癥介質發揮神經毒性作用，抑制神經的再生功能，加重神經元的損傷。膠質源性纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein，GFAP)是星形膠質細胞特有的一種細胞骨架蛋白，GFAP表達的多少可以反映星形膠質細胞的功能狀態。研究表明，山楂葉總黃酮(total flavone of hawthorn leaf，TFHL)對腦缺血神經元損傷具有保護作用[1]。但TFHL對星形膠質細胞的影響未見報道。本研究通過觀察TFHL對慢性腦缺血損傷后星形膠質細胞反應性增生的影響，進一步探究TFHL對慢性腦缺血神經組織的干預機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 成年雄性清潔級Spague-Dawley大鼠，24只，體質量250-280g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號:scxk(京)2006-2009。大鼠適應飼養一周，隨機分為假手術組、模型組、TFHL組，每組8只。

1.2 藥物與試劑 TFHL，山西振東泰盛制藥有限公司提供，純度98%，用蒸餾水配制，濃度為140mg/ml。GFAP抗體(免抗)、SABC免疫組化試劑盒、DAB試劑盒，均購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.3 動物模型制備及給藥 模型組、TFHL組均采用結扎雙側頸總動脈的方法制備慢性腦缺血模型:2%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉，頸部正中矢狀切口，鈍性分離皮下組織及筋膜，在頸動脈三角處游離出雙側頸總動脈，結扎并切斷雙側頸總動脈，縫合切口，術后24h內未蘇醒者剔除，并及時補遺。假手術組僅分離雙側頸總動脈，但不結扎。術后第14天開始，TFHL組給予TFHL(140mg/kg/d)灌胃，連續30d。假手術組及模型組給予等量生理鹽水灌胃，時間同TFHL組。

1.4 取材及指標檢測 2%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛左心室插管灌注固定，取腦組織，梯度酒精脫水，常規石蠟包埋，5μm連續冠狀切片，每隔3片取1張，共選5張。免疫組化法檢測GFAP的表達:石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2孵育，抗原修復;滴加GFAP一抗(1:100稀釋)，4℃孵育過夜;滴加二抗工作液，室溫孵育30min;滴加三抗SABC室溫孵育30min;DAB顯色;蘇木精復染;梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在400倍顯微鏡下，每只動物取3張代表切片，每片隨機選取5個視野，顯微攝像后，采用MiVnt圖像分析系統分析陽性產物面積占視野面積的比值。

1.5 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(±s)的形式表示，組間比較采用one-wayANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

GFAP陽性產物為棕黃色顆粒，位于星形膠質細胞胞漿及突起內。假手術組大鼠星形膠質細胞GFAP的表達呈弱陽性，膠質細胞突起較短、較細;與假手術組比較，模型組大鼠星形膠質細胞GFAP的表達增多、并呈強陽性表達，膠質細胞胞體腫脹、突起增粗，出現膠質瘢痕;與模型組比較，TFHL組大鼠星形膠質細胞GFAP的表達明顯減少，胞體腫脹減輕。定量分析結果:模型組大鼠GFAP的表達明顯高于假手術組(P＜0.01);與模型組比較，TFHL組大鼠GFAP的表達明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見附表。

附表 各組大鼠星形膠質細胞GFAP的表達( ±s)

附表 各組大鼠星形膠質細胞GFAP的表達( ±s)

與假手術組比較:*P＜0.01，與模型組比較:#P＜0.05

組別 劑量(mg/kg/d) GFAP的表達假手術組 - 0.27±0.16模型組 - 1.46±0.67*TFHL組 140 0.97±0.42#

3 討論

慢性腦缺血引起長期腦灌注不足可以導致神經組織的嚴重損害，其病理過程不僅包括神經元的變化，而且存在神經膠質細胞的變化。星形膠質細胞是腦內數量最多、分布最廣的一種神經膠質細胞，它是中樞神經系統的主要支持成份，參與多種生理反應。在腦損傷后，星形膠質細胞胞體變大，數目增多，出現反應性增生。目前對腦缺血的研究主要集中于如何保護缺血半暗帶區的神經細胞，而對膠質細胞，尤其星形膠質細胞的研究較少。

腦缺血時，星形膠質細胞從靜止狀態活化并增生，形成反應性星形膠質細胞增生，如損傷嚴重將形成膠質疤[2]。慢性腦缺血可損害海馬突觸可塑性引起學習記憶能力降低，腦缺血后海馬出現過度增殖的膠質細胞以及膠質疤痕的形成不僅影響正常的局部神經回路，而且可能是繼發癲癇以及認知功能損害的重要因素[3]。GFAP是星形膠質細胞特異性的標志蛋白，通過調節GFAP表達，有效抑制星形膠質細胞的過度活化，防止膠質疤痕的形成，將是腦保護研究的重點。

本研究顯示，模型組大鼠腦組織GFAP的表達明顯高于假手術組，提示慢性腦缺血可引起星形膠質細胞過度活化、增生，與文獻報道的結果一致[4]。TFHL干預后反應性星形膠質細胞增生的情況較模型組明顯改善，提示TFHL能抑制腦缺血誘發的星形膠質細胞過度活化，這可能是其腦保護作用的機制之一。盡管TFHL確有神經保護作用，值得注意的是反應性星形膠質細胞增生是一個動態的形成過程，因此抑制星形膠質細胞過度增生的確切機制仍需進一步深入研究。

[1]李麗靜,吳曉光，商亞珍.山楂葉總黃酮對腦缺血再灌注損傷的保護作用機制研究進展[J].承德醫學院學報,2013,30(2):148-151.

[2]Rossi D,Brady J,Mohr C.Astrocyte metabolism and signalin during brain ischemia[J].Nat Neurosci, 2007, 10(11): 1377 -1386

[3]Andersson M, Blomstrand F, Hanse E. Astrocytes play a critica role in transient heterosynaptic depression in the rat hippocampa CA1 region[J].J Physiol,2007,585(Pt 3):843 -852.

[4]王搖敏,張秋霞,鄒海艷,等.竹節參總皂苷對慢性腦缺血大鼠海馬GFAP、GAP-43表達的影響[J].世界中醫藥,2013,8(2):183-185.