杞藿飲對(duì)力竭游泳大鼠肝細(xì)胞衰老及其超微結(jié)構(gòu)的影響

徐紀(jì)平，劉保海，孫金山，肖立寧，陳來(lái)國(guó)，黃 文，李兆申

古今中外的戰(zhàn)爭(zhēng)史均已證實(shí)，作戰(zhàn)疲勞是影響部隊(duì)?wèi)?zhàn)斗力的重要原因，如何在長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)作戰(zhàn)中維持戰(zhàn)斗力及作戰(zhàn)后快速恢復(fù)疲勞，是國(guó)內(nèi)外軍事醫(yī)學(xué)尤其是軍事作業(yè)醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)課題之一。益氣滋陰、補(bǔ)精養(yǎng)神是對(duì)抗疲勞和快速恢復(fù)疲勞的有效手段。杞藿飲由刺五加、枸杞、淫羊藿、馬齒莧、紅景天、當(dāng)歸、肉蓯蓉等藥物配伍而成，具有益氣滋陰、補(bǔ)精養(yǎng)神等功效［1］。本實(shí)驗(yàn)觀察杞藿飲對(duì)力竭游泳大鼠肝細(xì)胞衰老及其超微結(jié)構(gòu)損傷的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)杞藿飲，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院研制的杞藿速釋片改良而成，由刺五加、枸杞、淫羊藿、馬齒莧、紅景天、肉蓯蓉等組成，由濟(jì)南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院中醫(yī)科煎制和濃縮，制成杞藿飲原汁、75%稀釋和1.5倍濃縮3種煎劑備用。(2)大鼠血清一氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate amino transferase，AST)試劑盒，均購(gòu)自南京建成科技有限公司;肝細(xì)胞H2A磷酸化染色試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品，超微結(jié)構(gòu)觀察使用日立H-7650分析透射電鏡。

1.2 動(dòng)物及分組 清潔級(jí)SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量(170±10)g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組12只，分別為:游泳對(duì)照組，蒸餾水灌胃;杞藿飲高(1.5倍濃縮液)、中(原液)、低(75%稀釋液)3個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組，按15 ml/kg體質(zhì)量給予相應(yīng)濃度杞藿飲煎劑灌胃，每日2次，其間大鼠自由飲水。力竭游泳實(shí)驗(yàn)在100cm×60cm×60cm的塑料泳槽桶中進(jìn)行，水深50cm，水溫(31±1)℃。大鼠力竭運(yùn)動(dòng)疲勞按Thomas報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷:大鼠沉入水中10 s不能自主上水面，且放在平面上無(wú)法完成翻正反射。實(shí)驗(yàn)為期3周。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)與評(píng)價(jià) (1)標(biāo)本收集。實(shí)驗(yàn)第22天，從各組大鼠腹主動(dòng)脈取血后，迅速解剖取肝臟組織，用冰冷的生理鹽水沖凈血漬，放入凍存管后置于液氮罐中保存待測(cè)。(2)血清NO、ALT和AST活性測(cè)定。所取主動(dòng)脈血不加抗凝劑收集，3000×g離心20 min，吸取上清液，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)NO、ALT和AST活性。(3)肝臟細(xì)胞H2A磷酸化染色。采用ABC染色法，按試劑盒方法操作，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野下肝臟組織中H2A陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，取平均值作為該標(biāo)本肝細(xì)胞衰老指數(shù)，用以評(píng)價(jià)肝細(xì)胞衰老的狀況。(4)肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察。肝臟標(biāo)本經(jīng)鋨酸、梯度脫水、樹(shù)脂包埋固化、超薄(70 nm)切片，再經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異用方差分析，P＜0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)肝臟生化指標(biāo)的影響 實(shí)驗(yàn)第22天，高、中、低濃度杞藿飲組大鼠血清NO、ALT、AST與游泳對(duì)照組比較均明顯降低(P＜0.05)，高、中濃度杞藿飲組大鼠血清NO、ALT、AST與低濃度組比較降低更明顯(P＜0.05)。提示，杞藿飲對(duì)力竭游泳所致大鼠肝臟損害具有保護(hù)作用，且與濃度呈正相關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清NO、ALT和AST活性比較(±s)

表1 各組大鼠血清NO、ALT和AST活性比較(±s)

注:NO為血清-氧化氮;ALT為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;AST為天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。與游泳對(duì)照組比較aP＜0.05;與低濃度杞藿飲組比較bP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù) NO(mmol/L) ALT(U/L) AST(U/L)游泳對(duì)照組12 68.20±11.23 218.01±43.77 793.80±63.44低濃度杞藿飲組 12 54.03±10.74a 149.82±32.73a 582.18±49.37a中濃度杞藿飲組 12 47.61±9.94ab 118.31±27.92ab484.11±63.39ab高濃度杞藿飲組 12 46.85±12.34ab121.81±26.66ab430.41±42.89ab

2.2 對(duì)肝細(xì)胞衰老的影響 肝臟衰老細(xì)胞磷酸化染色呈棕褐色，見(jiàn)圖1。計(jì)數(shù)各組每只大鼠各3個(gè)高倍(200倍)鏡視野下每100個(gè)肝細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值為衰老指數(shù)。低、中、高濃度杞藿飲組的衰老指數(shù)分別為7.99±0.55、7.33±0.49、6.85±0.74，與游泳對(duì)照組(10.05±1.09)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3個(gè)杞藿飲組肝細(xì)胞H2A磷酸化陽(yáng)性細(xì)胞均明顯少于游泳對(duì)照組(P＜0.05)，提示杞藿飲可以降低肝臟細(xì)胞衰老程度。

圖1 各組大鼠衰老肝細(xì)胞H2A染色結(jié)果(×200)

2.3 對(duì)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 電鏡下可見(jiàn)，游泳對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞基質(zhì)松散，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列紊亂，線粒體腫脹伴萎縮，出現(xiàn)嵴斷裂、消失、空泡樣變;3個(gè)杞藿飲組大鼠肝細(xì)胞病變較輕，線粒體基本正常，呈橢圓形，未見(jiàn)嵴斷裂，無(wú)空泡樣變。見(jiàn)圖2。提示杞藿飲可以降低疲勞大鼠肝細(xì)胞損傷程度。

圖2 各組大鼠肝細(xì)胞電鏡下超微結(jié)構(gòu)(×25 000)

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，持續(xù)疲勞主要耗氣傷陰，睡眠剝奪主要耗精傷神。因此，益氣滋陰、補(bǔ)精養(yǎng)神應(yīng)該是修復(fù)疲勞的有效手段。應(yīng)用淫羊藿、人參、黃芪、紅景天、刺五加、枸杞子、五味子等益氣養(yǎng)陰、益精寧神的中藥修復(fù)疲勞是可行的。杞藿飲以益氣養(yǎng)陰、益精寧神等多味藥物組成，以淫羊藿和枸杞為主要配方。目前研究已證明淫羊藿具有抗應(yīng)激、抗疲勞等作用，可促使患者術(shù)后白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白水平的恢復(fù)，減少術(shù)后的疲勞程度，且能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能［2-3］。枸杞具有增強(qiáng)和調(diào)節(jié)免疫功能、增強(qiáng)造血功能、抗腫瘤等作用［4-5］。這些藥物合用對(duì)抗疲勞有明顯的功效。

肝臟是人體最大的腺體，肝臟與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系極為密切，運(yùn)動(dòng)時(shí)血液的重新分布會(huì)導(dǎo)致肝臟等內(nèi)臟器官血供減少，運(yùn)動(dòng)時(shí)能源物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的堆積等也都會(huì)從不同方面影響肝臟組織的結(jié)構(gòu)和功能［6-7］。本研究觀察到，力竭游泳大鼠伴有明顯的肝臟損傷，表現(xiàn)為NO、ALT、AST等酶譜的改變，電鏡下線粒體損傷，給予杞藿飲可以減輕肝臟的損傷程度，肝酶譜明顯降低。由此認(rèn)為，杞藿飲對(duì)預(yù)防疲勞所致的肝臟損傷及對(duì)疲勞的快速恢復(fù)起重要作用。

細(xì)胞衰老是細(xì)胞生命活動(dòng)的客觀規(guī)律［8］。細(xì)胞凋亡通常作為評(píng)定運(yùn)動(dòng)性疲勞與恢復(fù)的可行性指標(biāo)，一般認(rèn)為程序性細(xì)胞衰老凋亡是一種利他性、生理性細(xì)胞死亡，即局部、個(gè)別的死亡有利于整體或種群的存活［9］。與以往研究觀察疲勞動(dòng)物的肝細(xì)胞凋亡不同，本研究重點(diǎn)觀察肝細(xì)胞的衰老狀態(tài)，通過(guò)觀察細(xì)胞衰老指數(shù)，判斷疲勞對(duì)肝臟的損傷程度，進(jìn)一步觀察到抗疲勞制劑杞藿飲能夠有效降低肝細(xì)胞的衰老，進(jìn)而減少細(xì)胞的凋亡，保護(hù)肝臟功能，達(dá)到緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的效果。

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