干預(yù)NRG-1/ErbB通路對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞向類竇房結(jié)細(xì)胞分化的影響

李 勇，李賓公，肖 堅(jiān)，李 哲，張 健

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西省高血壓病研究所，江西南昌 330006)

生物起搏細(xì)胞治療的原理就是利用干細(xì)胞具有多向分化的潛能，使其分化為具有起搏功能的細(xì)胞，對(duì)受損的自律性節(jié)律點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)或替代，使心臟的起搏功能得以修復(fù)［1］，目前所用的細(xì)胞主要為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。目前的研究［2］發(fā)現(xiàn)由人胚胎干細(xì)胞分化而來(lái)的心肌樣細(xì)胞可檢測(cè)類竇房結(jié)樣動(dòng)作電位(action potential，AP)，其具有AP幅度小，沒(méi)有明顯的平臺(tái)期，能夠4期自動(dòng)去極化等特點(diǎn)。由此可見(jiàn)在一定的條件下胚胎干細(xì)胞等多潛能干細(xì)胞在體外也能分化為能產(chǎn)生自發(fā)性動(dòng)作電位的起搏細(xì)胞，但胚胎干細(xì)胞因?yàn)槊庖邔W(xué)及倫理問(wèn)題難以應(yīng)用于臨床。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(neuregulins-1，NRG-1)是目前研究較多的一類心血管系統(tǒng)中重要的信號(hào)蛋白，通過(guò)介導(dǎo)酪氨酸激酶受體(ErbB2、ErbB3和ErbB4)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在心肌細(xì)胞的發(fā)育成熟、分化中發(fā)揮重要的作用［3］。因此本研究把脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells，ADSCs)做為實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞，觀察干預(yù)NRG-1/ErbB通路對(duì)大鼠ADSCs心肌樣分化的影響。探討通過(guò)干預(yù) NRG-1/ErbB通路調(diào)控ADSCs向類竇房結(jié)細(xì)胞或工作肌樣細(xì)胞分化的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料主要試劑:5-Aza、AG 1478、I型膠原酶購(gòu)自Sigma公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，bFGF、NRG-1β購(gòu)自Peprotech公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自Hyclone公司 ，TRIzol Reagent、RT-PCR引物購(gòu)自Invitrogen公司，兔抗鼠 CD44、CD90、CD105、CD31、TBX3抗體購(gòu)自北京博奧森，兔抗鼠肌鈣蛋白I購(gòu)自Abcam公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠 ADSCs的原代培養(yǎng) 按文獻(xiàn)［4－5］中的方法提取ADSCs:取4周左右SD大鼠，脫臼處死，取其腹股溝及附睪處脂肪，仔細(xì)剔除肉眼可見(jiàn)的血管和筋膜，充分剪碎，0.75 mg·g－1Ⅰ型膠原酶37℃振蕩消化45～60 min，加入等體積的培養(yǎng)基，1500 r·min－1離心5 min，去上清加入5 ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再離心，如此重復(fù)3次后，再用200目的篩網(wǎng)過(guò)濾，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后換液。待貼壁細(xì)胞近鋪滿瓶底約80%左右時(shí)，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 ADSCs鑒定 取貼壁于細(xì)胞爬片上的3代ADSCs，室溫下多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗3遍，每遍 2 min，10 g·L－1的 BSA 37℃封閉 30 min后，分別加入兔抗鼠 CD44、CD90、CD105、CD31(抗體濃度均為1∶100)，4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3遍，每遍5 min，再加入TRITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(濃度均為1∶100)，37℃孵育 60 min，PBS沖洗3遍，每遍5 min，再分別加入50 mg·L－1的 DAPI 37℃孵育30 min后，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 ADSCs的誘導(dǎo)分化 取生長(zhǎng)良好的3代ADSCs均勻接種于12孔板內(nèi)，待細(xì)胞鋪滿約60%～70%時(shí)，隨機(jī)取9孔用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓2 h后，改為適合心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基(高糖DMEM+20%FBS)培養(yǎng)，再加入終濃度為 10 μmol·L－1的 5-Aza 和10 μg·L－1的bFGF 處理24 h 后，隨機(jī)分成3組，其中對(duì)照組:加5-Aza后一直正常培養(yǎng);AG1478組:在加入5-Aza后第5～11天每隔3天加入終濃度為 10 μmol·L－1的 ErbB 受體拮抗劑 AG1478，每次處理時(shí)間為12 h;NRG-1組:在與AG1478組同一時(shí)間內(nèi)加入終濃度為 100 μg·L－1的 NRG-1β。余下未處理的為ADSCs組一直正常培養(yǎng)。3周后行心肌特異性基因，蛋白及膜片鉗檢查，每組重復(fù)不小于3次。

1.2.4 RNA的提取及RT-PCR 提取鑒定后的3代ADSCs總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)及引物反應(yīng)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和目的基因擴(kuò)增，檢測(cè)其NRG-1、ErbB2、ErbB3、ErbB4基因的表達(dá)。各種引物序列、擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度及退火溫度見(jiàn)Tab 1，反應(yīng)體系為25 μl。反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性 5 min，94℃ 變性30 s，55℃ ～63℃退火 30 s，72℃延伸 10 s，循環(huán) 30次，最后72℃延伸5 min，在0.15%的瓊脂糖凝膠中電泳(80V，60 min)檢測(cè)聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物。用同樣方法，檢測(cè)誘導(dǎo)3周后各組TBX3、Nkx2.5、Hcn4、TBX2基因的表達(dá)差異。用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)掃描和分析結(jié)果，以GAPDH為內(nèi)參作相對(duì)定量分析，數(shù)值以兩條帶的凈面積比值表示。每次實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞各取3個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)次數(shù)不小于3次。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)各組肌鈣蛋白的表達(dá) 誘導(dǎo)3周后，將細(xì)胞接種于鋪有纖維黏連蛋白的培養(yǎng)板上，行免疫熒光檢測(cè)肌鈣蛋白I的表達(dá)，方法同前，一抗為兔抗鼠肌鈣蛋白I(濃度為1∶150)，二抗為TRITC標(biāo)記的羊抗兔(濃度為1∶150)。

1.2.6 Western blot檢測(cè) TBX3 蛋白的表達(dá)差異誘導(dǎo)3周后從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，提取其總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)入NC膜上，TBX3抗體(1∶500)或β-actin(1∶10 000)4℃孵育過(guò)夜，相對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2 h，PBST清洗干凈后，行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。用 Image quant las 4000自動(dòng)曝光掃描條帶并分析結(jié)果，以βactin為內(nèi)參做相對(duì)定量分析。

Tab 1 Primer sets used for RT-PCR

1.2.7 膜片鉗檢測(cè)各組動(dòng)作電位 將誘導(dǎo)3周后的細(xì)胞使用電流鉗模式，給予脈寬5毫秒(ms)、電流900皮安(pA)刺激，頻率1赫茲(Hz)刺激細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位，信號(hào)由膜片鉗放大器(AXON700B，USA)放大，采樣后獲得的數(shù)據(jù)用 Campfit 9.0進(jìn)行分析，并測(cè)量APD50、APD90、APA等電位參數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，結(jié)果由SPSS 17.0軟件做單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的形態(tài)、鑒定及NRG-1/ErbB相關(guān)基因的表達(dá)細(xì)胞接種24 h后可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁，初為小圓形，48 h后去除含大量脂滴的培養(yǎng)基，可見(jiàn)貼壁細(xì)胞逐漸向兩側(cè)伸出突起，呈梭形，集落樣生長(zhǎng)，約7 d左右可鋪滿單層。傳到第3代時(shí)，細(xì)胞已變得大小、形態(tài)均一，呈短梭形或近三角形。行免疫熒光檢測(cè)表達(dá)干細(xì)胞特異性表面抗原CD44、CD90、CD105，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)抗原 CD31(Fig 1)。RT-PCR檢測(cè)鑒定后的3代 ADSCs表達(dá) NRG-1、ErbB2、ErbB3、ErbB4 基因(Fig 2)。

2.2 誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)變化及肌鈣蛋白的表達(dá)大鼠ADSCs加5-Aza誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞的增長(zhǎng)逐漸變得緩慢，形態(tài)出現(xiàn)明顯變化。誘導(dǎo)7 d后，細(xì)胞中呈長(zhǎng)梭形細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞排列開(kāi)始出現(xiàn)規(guī)則，部分細(xì)胞出現(xiàn)雙核或多核。誘導(dǎo)3周后，除ADSCs組外各組均可見(jiàn)大量細(xì)胞變小呈束狀排列或呈漩渦狀融合，高倍下可見(jiàn)大量呈短梭形或有放射狀突起的多核細(xì)胞。行免疫熒光檢測(cè)對(duì)照組、NRG-1組、AG1478組均可見(jiàn)表達(dá)肌鈣蛋白I的細(xì)胞(未行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較各組誘導(dǎo)分化率)，而未經(jīng)誘導(dǎo)的ADSCs組不表達(dá)(Fig 3)，證明加5-Aza后各組均向心肌樣細(xì)胞分化，對(duì)照組(只加5-Aza)誘導(dǎo)陽(yáng)性率約為30%。

2.3 干預(yù)NRG-1/ErbB通路對(duì)起搏相關(guān)基因及蛋白的影響通過(guò)RT-PCR分析各組mRNA(Fig 4)示大鼠ADSCs加入5-Aza誘導(dǎo)21 d后，表達(dá)心臟早期轉(zhuǎn)錄因子 Nkx2.5，而ADSCs組不表達(dá)(P＜0.05)，進(jìn)一步證明用5-Aza使ADSCs向心肌樣細(xì)胞分化。而在分化早期的適當(dāng)時(shí)間內(nèi)加入 AG1478組其HCN4、TBX3、TBX2的表達(dá)均強(qiáng)于對(duì)照組(只加5-Aza)及NRG-1組(P＜0.05)，提示細(xì)胞向竇房結(jié)樣細(xì)胞分化;而加NRG-1組其Nkx2.5的表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組及AG1478組(P＜0.05)，提示細(xì)胞向工作肌樣細(xì)胞分化。誘導(dǎo)3周后，Western blot分析各組TBX3蛋白(Fig 5)也證實(shí)AG1478組TBX3蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。

Fig 3 Expression of troponin I in ADSCs after differentiation for 3 weeks tested by Immunofluorescence staining(×400)

2.4 實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)作電位的表達(dá)差異膜片鉗檢測(cè)ADSCs組未見(jiàn)能產(chǎn)生動(dòng)作電位的細(xì)胞;對(duì)照組共檢測(cè)26個(gè)細(xì)胞，其中2個(gè)表達(dá)竇房結(jié)樣動(dòng)作電位，5個(gè)表達(dá)心室肌樣動(dòng)作電位(Fig 6);AG1478組共檢測(cè)30個(gè)細(xì)胞，4個(gè)表達(dá)竇房結(jié)樣動(dòng)作電位，3個(gè)表達(dá)心室肌樣動(dòng)作電位;而加NRG-1組共檢測(cè)28個(gè)細(xì)胞，1個(gè)表達(dá)竇房結(jié)樣動(dòng)作電位，7個(gè)表達(dá)心室肌樣動(dòng)作電位(因樣本數(shù)目太少未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析)。竇房結(jié)樣動(dòng)作電位的振幅(APA)為(78±4)mV，復(fù)極化至50%，90%的動(dòng)作電位時(shí)程(APD50/APD90)為(121±10.5)ms和(196±14)ms，心室肌樣動(dòng)作電位的振幅為(102±5)mV，APD50/APD90為(168.7±22)ms和(275±26)ms。

3 討論

脂肪干細(xì)胞(ADSCs)是近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)的一種脂肪來(lái)源成體干細(xì)胞，具有多方向分化的潛能，體外實(shí)驗(yàn)表明［6－7］，在一定條件誘導(dǎo)下可分化為心肌、神經(jīng)、血管內(nèi)皮、脂肪、軟骨等細(xì)胞。而且ADSCs因?yàn)閬?lái)源廣，取材方便，不涉及免疫原性及倫理道德問(wèn)題，能自體移植，與其它干細(xì)胞相比有明顯的優(yōu)越性，是目前心肌組織工程研究有很大臨床應(yīng)用潛力的種子細(xì)胞。在本課題中，我們分離培養(yǎng)大鼠ADSCs，免疫熒光鑒定其表達(dá)干細(xì)胞特征性抗原CD90、CD44、CD105，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)抗原CD31，符合干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)［4，8］。

在本研究中，我們通過(guò) RT-PCR檢測(cè)出大鼠ADSCs表達(dá) NRG-1及 ErbB2、ErbB3、ErbB4基因，ELISA發(fā)現(xiàn)ADSCs也能分泌NRG-1(該文章未詳細(xì)描述)證明ADSCs表達(dá)完整的NRG-1/ErbB信號(hào)通路。通過(guò)RT-PCR及Western blot我們發(fā)現(xiàn)在ADSCs向心肌樣細(xì)胞分化的一定時(shí)間內(nèi)，短期使用AG1478抑制 NRG-1/ErbB信號(hào)通路，能明顯提高 TBX3、HCN4基因及TBX3蛋白的表達(dá)，并且能夠檢測(cè)到竇房結(jié)樣動(dòng)作電位。反之增加外源性NRG-1則可以增加心肌早期轉(zhuǎn)錄因子NKx2.5的表達(dá)。TBX3作為轉(zhuǎn)錄因子抑制劑，在早期心臟的發(fā)育中能抑制心肌工作肌細(xì)胞相關(guān)基因［9］，上調(diào)各起搏相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)竇房結(jié)細(xì)胞的分化成熟［10］，常和HCN4作為起搏組織的標(biāo)志基因［11－12］;而NKx2.5在早期心臟發(fā)育的一定時(shí)間內(nèi)可以抑制TBX3、HCN4等起搏相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞向工作肌樣細(xì)胞分化［13］，反之當(dāng)Nkx2.5表達(dá)被抑制時(shí)則起搏相關(guān)基因的表達(dá)明顯增強(qiáng)［14］。據(jù)此我們可以推測(cè)NRG-1/ErbB通路在調(diào)控干細(xì)胞的定向分化中發(fā)揮著重要作用，并且這一作用可能與NKx2.5、TBX3等基因密切相關(guān)。今后可以通過(guò)干預(yù)這一通路使ADSCs向不同方向分化，為未來(lái)不同心臟病的定向修復(fù)提供新的手段。

Fig 4 (A)Expression of cardiac subtype-specific genes in ADSC，control(5-Aza)，AG1478，and exogenous NRG-1 treated group after induced 3 weeks detected by RT-PCR.(B)Statistical analysis of the expression of NKx2.5.(C)Statistical analysis of the expression of TBX3，TBX2 and HCN4

心臟的發(fā)生與成熟是一個(gè)多種信號(hào)通路先后參與的非常復(fù)雜而又精細(xì)的調(diào)控過(guò)程，目前的研究表明NRG-1/ErbB信號(hào)系統(tǒng)在早期心肌細(xì)胞的分化成熟過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，但其機(jī)制現(xiàn)在仍不完全清楚［15］。在成熟心臟中，NRG-1主要通過(guò)使ErbB2/ErbB4異源二聚體磷酸化，激活下游的信號(hào)分子而發(fā)揮重要的生理作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、凋亡，分化，維護(hù)心臟正常的結(jié)構(gòu)及功能［16］，并且補(bǔ)給外源性的NRG-1亦可抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能［17］。在脊椎動(dòng)物胚胎的發(fā)育中 NRG-1/ErbB信號(hào)系統(tǒng)通過(guò)與心臟其它早期轉(zhuǎn)錄因子如Nkx2.5、TBX3等相互作用參與并形成調(diào)控心臟發(fā)育特殊的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(cardiac-specific gene regulatory network)，調(diào)控心臟前體細(xì)胞的分化成熟［18］，在胚胎發(fā)育中抑制NRG-1/ErbB信號(hào)通路可以促進(jìn)竇房結(jié)的發(fā)育［19］，而在胚胎干細(xì)胞中添加外源性的NRG-1則能增加工作肌相關(guān)基因(如Nkx2.5)的表達(dá)，促進(jìn)其向工作肌細(xì)胞分化［20］。

總之，在本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)在脂肪干細(xì)胞的心肌樣分化中調(diào)控NRG-1/ErbB信號(hào)系統(tǒng)可以調(diào)控脂肪干細(xì)胞向起搏樣細(xì)胞或工作肌樣細(xì)胞分化，這可用于未來(lái)生物起搏或心肌損傷的修復(fù)研究，提示NRG-1有可能成為未來(lái)干細(xì)胞治療心血管疾病的一個(gè)重要調(diào)節(jié)點(diǎn)，當(dāng)然對(duì)其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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