梓醇增強缺血灶周圍大腦皮質神經元軸突芽生及突觸新生

萬 東，?；埒P，羅 勇，謝 鵬

(重慶醫科大學附屬第一醫院1.急診醫學科＆重癥醫學科、3.神經內科，重慶 400016;2.西南大學藥學院暨中醫藥學院，重慶 400716)

缺血性腦卒中后梗死灶周圍大腦皮質(peri-infarct cortex，PIC)軸突芽生(axonal sprouting)是具有代表性的神經修復事件。芽生軸突可形成新的功能性突觸連接，即突觸新生(synaptogenesis)，參與卒中后神經環路重構，奠定功能恢復的結構基礎。因此，以PIC區軸突芽生和突觸新生為研究切入點，可望篩選出有效促進腦卒中后神經修復的藥物或治療手段。

梓醇是地黃的主要活性成分，具有確切的腦保護作用和促神經修復效應。課題組及國內外其他學者研究發現［1－4］，梓醇可促進神經元軸突生長，改善腦卒中大鼠神經缺失功能恢復狀況。但梓醇能否促進芽生軸突形成新的突觸終末尚不明確。因此，本研究制備大鼠大腦中動脈永久性閉塞模型，采用生長相關蛋白43(growth associated protein-43，GAP-43)標記芽生軸突，突觸素(synaptophysin，P38)標記突觸前終末，激光共聚焦檢測PIC區GAP-43和P38共定位信號，觀察梓醇對PIC區芽生軸突形成突觸的影響;進一步采用透射電鏡結合體視學方法檢測PIC區突觸數密度(number density，Nv)和面密度(sarface density，Sv)，觀察梓醇對突觸重構的影響。通過上述研究，以期為明確回答梓醇能否促進有效軸突芽生，能否增強突觸新生及突觸重構能力等問題提供直接的形態學依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組36只成年健康Sprague-Dawley大鼠，♀♂不拘，體質量220～250 g，購自重慶醫科大學實驗動物中心(合格證號:檢動字2002A040)。隨機分為假手術組(n=6)，模型組(n=6)，生理鹽水組(n=6)，梓醇低劑量組(n=3)、中劑量組(n=6)、高劑量組(n=3)和胞磷膽堿組(陽性藥物對照組，n=6)。

1.2 藥品與器材梓醇購自中國藥品生物制品檢定所(產品批號:110808-200508，規格:20 mg/支)，胞磷膽堿鈉注射液為山西晉新雙鶴藥業有限責任公司產品(國藥準字 H14021994，規格:125 g·L－1)。小鼠抗突觸素(P38)單克隆抗體、兔抗GAP-43多克隆抗體、Cy3標記羊抗兔IgG、FITC標記羊抗小鼠IgG均購于武漢博士德生物工程有限公司。Leicacm1850型冰凍切片機、TCS SP2型激光共聚焦掃描顯微鏡和Leica-EM UC7超薄切片機均為德國徠卡公司產品，H7500型透射電子顯微鏡為日本日立公司產品。

1.3 模型制備右顳側低位開顱，電凝大腦中動脈位于嗅束與大腦下靜脈之間的一段，制備局灶永久性腦缺血模型。假手術組除不凝閉右側大腦中動脈外，其余步驟與模型組相同。術中保持直腸溫度在36.5℃ ～37.5℃。

1.4 模型成功的判斷與納入標準術后24 h，采用Bederson評分評估受累肢體神經缺失功能狀況:0分，無神經功能缺失癥狀;1分，左前肢屈曲，但不伴其他異常，即提尾懸空實驗陽性;2分，提尾懸空實驗陽性，同時側推抵抗力下降(即側向推力實驗陽性)，但自由活動時無轉圈行為;3分，同2分行為，且自由活動時向癱瘓側轉圈。評分為1～3分的大鼠納入實驗。

1.5 藥物干預梓醇低、中、高劑量分別為1、5、10 mg·kg－1，胞磷膽堿給藥劑量為 0.5 g·kg－1。梓醇和胞磷膽堿均用生理鹽水配制，每次給藥總體積為3 ml。生理鹽水組腹腔注射等體積生理鹽水。假手術組和模型組不給予任何藥物干預。藥物干預組均于術后24 h首次經腹腔注射給藥，每日1次，連續7 d。

1.6 PIC區GAP-43和P38共定位信號檢測與分析

1.6.1 標本采集與切片制備 術后d 15，每組取3只大鼠，深麻醉后用質量分數為4%的多聚甲醛灌流固定，參照大鼠腦立體定向圖譜，采集視交叉前后2 mm范圍的腦組織塊(含感覺運動皮質區)，速凍后制備30 μm厚的連續冠狀位腦片，每隔5張取1張，每只大鼠共取10張腦片用于免疫熒光雙標組織化學染色。

1.6.2 免疫熒光雙標組織化學染色步驟 采用自由漂浮法免疫熒光組織化學染色，用FITC顯示P38陽性表達，Cy3顯示 GAP-43陽性表達。腦片用0.02 mol·L－1PBS漂洗3次，正常山羊血清工作液室溫封閉30 min;轉入GAP-43和P38混合一抗工作液(GAP-43和P38一抗工作濃度分別為1∶400和1∶200)，4℃孵育過夜(14～16 h)，陰性對照用0.02 mol·L－1PBS 代替一抗工作液;0.02 mol·L－1PBS漂洗腦片3次，轉入Cy3標記羊抗兔IgG(稀釋比例為1∶200)和FITC標記羊抗小鼠IgG(稀釋比例為1∶100)混合工作液中，37℃避光孵育1 h;0.02 mol·L－1PBS漂洗腦片4次，裱片，緩沖甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6.3 PIC區GAP-43和P38共定位信號分析 腦片置于TCS SP2型激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，每只動物觀察3張完整的腦片，相同光學條件下每張腦片隨機拍攝PIC區(距病灶邊緣1～3 mm腦區)3個互不重疊的視野，分別測量紅色熒光強度系數(表征GAP-43表達強弱)和綠色熒光強度系數(表征P38表達強弱)，并用系統自帶軟件進行圖像疊加處理，獲得GAP-43和P38共定位信號圖像(共定位信號呈黃色)，采用NIH ImageJ圖像分析軟件，分析每組圖像的Pearson相關系數，以間接反映共定位像素值的大小。取各指標27個視野的平均值進行統計分析。

1.7 電鏡標本制備及PIC區突觸定量分析

1.7.1 電鏡標本制備 術后d 15，將假手術組、模型組、生理鹽水組、梓醇中劑量治療組和胞磷膽堿治療對照組余下的3只大鼠深麻醉后灌流固定，首先灌流生理鹽水100 ml，然后用含4%多聚甲醛、2%戊二醛的0.1 mol·L－1磷酸鹽緩沖液(PBS)灌流固定30 min。快速斷頭取腦，取視交叉前后2 mm的腦組織塊(含大腦運動皮質區)，冰臺上分離缺血灶周邊1～3 mm范圍的幸存感覺運動皮質，制備1 mm×1 mm×1 mm大腦皮質塊，放入4%戊二醛(用0.1 mol·L－1PBS配制)溶液中固定3～4 h;再用0.1 mol·L－1PBS溶液清洗組織塊3次，每次15 min，繼之 1%鋨酸后固定 1 h(4℃)，0.1 mol·L－1PBS溶液清洗組織塊3次，每次15 min。常規脫水透明，618型環氧樹脂包埋，半薄切片定位后，采用Leica-EM UC7型超薄切片機制備厚度60 nm的超薄切片，切片裱于300目銅網上，后經醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色，H7500型透射電子顯微鏡下觀察。

1.7.2 圖像采集與體視學定量分析 電腦采集圖像，自左上往右下順序采集圖片12張，放大倍數均4萬，每組測定36張電鏡照片。參照文獻［5］，采用突觸體視學銅網格法計算突觸Nv和Sv。電鏡下突觸的辨認標準:①可見突觸前后膜;② 可見突觸間隙;③可見突觸后致密帶。

1.8 統計學處理每組數據以±s表示，采用SPSS 11.5版本進行單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較用SNK法。

2 結果

2.1 梓醇促進PIC區有效軸突芽生熒光顯微鏡下見，綠色熒光顯示P38標記的突觸前末端，紅色熒光顯示GAP-43表達陽性的芽生軸突，GAP-43和P38共定位信號呈現黃色，顯示新生軸突形成突觸的部位。PIC區幸存大腦皮質神經氈內，可見點狀和顆粒狀密集分布的突觸素P38陽性著色部位(呈現綠色熒光)，部分陽性顆粒圍繞在神經元周圍，襯托出神經元胞體的輪廓;GAP-43在神經元及神經突起上表達較強，陽性著色部位呈點狀、索條狀，部分位于神經元胞質內;黃色的GAP-43/P38共定位顆粒散在分布于神經氈內，部分顆粒在神經元周圍密集分布，顯示出神經元胞體和突起的外形特征。陰性對照腦片未見陽性熒光信號。見Fig 1。

Fig 1 Representative images showing co-localisation(yellow)of P38(green)with GAP-43(red)in PIC region in each group

GAP-43和P38共定位分析，紅色熒光強度系數間接反映GAP-43陽性表達信號強弱，系數越大GAP-43陽性表達水平越高。紅色熒光強度系數模型組和生理鹽水組均高于假手術組，但差異無顯著性(P＞0.05)，梓醇各劑量組均明顯高于模型組(P＜0.05)，且梓醇中劑量組明顯高于胞磷膽堿組(P＜0.05);提示梓醇可促進腦缺血后軸突芽生。綠色熒光強度系數間接反映P38表達量，系數越大，P38表達水平越高。各組間比較，梓醇各劑量組綠色熒光強度系數均比模型組和胞磷膽堿組明顯增加(P＜0.05)，提示梓醇可增強腦缺血后突觸重構。GAP-43和P38之間Pearson相關系數反映芽生軸突形成突觸連接的頻度。Pearson相關系數越大表明芽生軸突形成突觸連接越多。模型組和生理鹽水組Pearson相關系數明顯大于假手術組(P＜0.05)，提示腦缺血后存在自發性軸突芽生及突觸新生;梓醇各劑量組均比模型組明顯增大(P＜0.05)，且梓醇中、高劑量組明顯大于胞磷膽堿組，差異具有顯著性(P＜0.05)，提示梓醇可促進芽生軸突形成新的突觸連接。見Tab 1。

Tab 1 Comparison of parameters of co-localisation of P38/GAP-43 within PIC region in each group(±s，n=3)

Tab 1 Comparison of parameters of co-localisation of P38/GAP-43 within PIC region in each group(±s，n=3)

*P ＜0.05 vs sham operation group，▲P ＜0.05 vs model group，★P ＜0.05 vs citicoline treatment group.

Group co-localisation of P38/GAP-43/Pearson's correlation coefficient Sham operation 1.04±0.11 0.60 ±0.02 0.14±0.02 P38 expression/green fluorescence intensity GAP-43 expression/red fluorescence intensity Model 1.19±0.10* 0.66 ±0.09 0.27±0.04*Saline 1.14±0.18* 0.68 ±0.03 0.32±0.03*Citicoline 1.01±0.09 0.85 ±0.07＊▲ 0.48±0.01＊▲Low dose of catalpol 1.31±0.03＊▲★ 0.83±0.03＊▲ 0.50±0.04＊▲Middle dose of catalpol 1.38±0.10＊▲★ 0.92±0.06＊▲★ 0.63±0.03＊▲★High dose of catalpol 1.53±0.19＊▲★ 0.80±0.10＊▲ 0.72±0.06＊▲★

2.2 梓醇增加PIC區突觸數密度和面密度體視學定量分析結果顯示，與假手術組相比，模型組和生理鹽水組PIC區神經氈內突觸Nv和Sv均明顯降低(P＜0.05)，提示腦缺血損傷后存在突觸丟失現象;中劑量梓醇組Nv和Sv均比模型組和生理鹽水組明顯增加(P＜0.05)，但與胞磷膽堿組差異無顯著性(P＞0.05)，接近假手術組水平(P＞0.05)，提示梓醇可明顯促進腦缺血后突觸重構。見Fig 2和Tab 2。

3 討論

缺血性腦卒中所致神經缺失功能的恢復依賴于缺血周圍區幸存腦組織及病灶對側功能相似腦區激活、結構重塑和功能重建。卒中后最初幾周內，腦區激活較為泛化，涉及病灶同側及對側的多個腦區;隨著神經缺失功能恢復及病程延長，泛化的腦區活化模式逐步被PIC區活化這一局限的類似生理狀態的活化模式所取代［6］。因此，PIC區的神經可塑性事件一直是卒中后神經修復研究的焦點。

神經元軸突芽生及突觸新生是PIC區代表性神經可塑性事件，其發生發展具備一定的時空特點。時間上，軸突芽生存在4個關鍵時段［7］:卒中后最初3 d內為軸突芽生觸發階段;3～7 d為起始階段，伴隨大量生長促進因子表達上調;7～14 d進入維持階段，大部分軸突生長，促進蛋白呈峰值表達并維持在平臺水平，如GAP-43、CAP23及c-jun等;14～28 d進入軸突芽生終末階段，此時新的軸突投射模式基本構建完畢。空間上，大鼠感覺運動皮質小灶梗死后，梗死灶周邊2 mm范圍的幸存腦組織軸突芽生最明顯［7－8］?？梢姡渲泻?周是對軸突芽生和突觸新生進行過程性評價的關鍵時點，梗死灶周邊1～3 mm的環形腦區是研究卒中后軸突芽生/再生和突觸新生的重要區域。

Fig 2 Representative electron micrographs used to evaluate synapse(arrow)density within peri-infarct cortex

Tab 2 Comparison of synaptic number density and surface density within PIC region in each group(±s，n=3)

Tab 2 Comparison of synaptic number density and surface density within PIC region in each group(±s，n=3)

▲P ＜0.05 vs sham operation group;△P ＜0.05 vs model group.

Group Number density/Nv，number/μm3 Surface density/Sv，μm2/μm3 Sham operation 0.85 ±0.36 0.066 ±0.025 Model 0.54 ±0.28▲ 0.036 ±0.032▲Normal saline 0.58 ±0.37▲ 0.041 ±0.034▲Citicoline 0.76 ±0.36△ 0.059 ±0.02△Middle dose of catalpol 0.78 ±0.42△ 0.062 ±0.03△

神經元軸突芽生/再生和突觸新生需要合成新的蛋白以調節生長錐的形成、維持和延伸，并使軸突芽生與突觸新生同步化。其中，GAP-43是一種分子量為43 ku的神經特異性蛋白，富集于軸突生長錐質膜，參與軸突生長錐形成，引導軸突生長和延伸，調節軸突芽生與新突觸形成同步化，是國際公認的軸突再生分子標志。突觸素P38是突觸前囊泡特有的鈣結合糖蛋白，與神經遞質釋放、突觸囊泡再循環和突觸新生等都有密切關系，是突觸前終末的特異性分子標記物，也是突觸傳遞效能的反映。在腦損傷后軸突生長維持階段，P38與GAP-43的比值可反映突觸新生能力，但芽生軸突建立突觸連接后，GAP-43的表達下調，趨于基線水平［9］。腦缺血損傷后，由于能量代謝障礙，蛋白表達譜調節異常以及中樞神經系統軸突生長限制性微環境等諸多因素影響，相當一部分芽生軸突不能形成功能性突觸連接，即無效軸突芽生。成熟期線蟲的運動神經元軸突切斷后，大約70%的受損軸突末端形成了生長錐，但僅有不到10%的芽生/再生軸突與靶組織建立了連接［10］。因此，促進芽生軸突形成新的突觸連接(即有效軸突芽生)成為重要的神經修復策略。

課題組前期研究觀察到［3－4］，梓醇可上調局灶腦缺血大鼠梗死灶周圍區大腦皮質GAP-43表達，增加腦梗死灶周圍區大腦皮質神經氈內突觸數目，但梓醇能否誘導新生軸突形成突觸尚未進行探討。因此，本研究采用免疫熒光雙標組織化學染色技術，用GAP-43標記芽生軸突，P38標記突觸，GAP-43和P38共定位顯示芽生軸突形成的新的突觸終末，觀察梓醇對新生軸突形成突觸的影響。結果發現腦缺血后15 d，PIC區神經氈內可見大量GAP-43和P38共定位信號，呈黃色，密集分布在神經元周圍，顯示出神經元胞體和突起的外形特征。量化分析各組GAP-43和P38共定位信號，結果梓醇治療組Pearson相關系數明顯高于其他實驗組(P＜0.05)，表明梓醇組有更多的芽生軸突形成了突觸前末端，提示梓醇可促進芽生軸突形成新的突觸連接。

既往研究證實，胞磷膽堿是磷脂生物合成過程中的一種關鍵物質，參與卒中后神經生成、軸突芽生/再生以及突觸生成過程。外源性給予胞磷膽堿可加快磷脂合成和神經修復，目前廣泛用于卒中后神經修復治療［11］。近期研究發現，胞磷膽堿可促進卒中后神經再生［12］，誘導樹突芽生［13］，上調突觸素表達［14］，與梓醇具有相似的神經藥理作用機制，故課題組將其作為陽性藥物對照。本研究結果顯示，梓醇較胞磷膽堿更能誘導新生軸突形成新的突觸，提示梓醇作為神經修復治療藥物極具臨床轉化潛能。

腦缺血后受累神經元突觸數量減少，效能降低，神經環路信息傳遞障礙是腦缺血后出現神經功能障礙的重要因素。新突觸形成、突觸數密度增加、突觸面密度增大以及突觸傳遞效能增強是突觸重構的主要體現。突觸數密度是指一定參照空間內突觸的數目，直接反映神經活動過程中神經元接點數目的多少;突觸面密度是指一定參照空間內突觸的總面積，直接反映神經活動中神經元接點面積的大小。本研究在證實梓醇可促進芽生軸突形成新的突觸終末的基礎上，進一步采用透射電鏡結合體視學方法定量檢測PIC區突觸數密度和面密度，評價梓醇對突觸重構的終末效應。結果發現中劑量梓醇治療組PIC區突觸的數密度和面密度均比模型組和生理鹽水組明顯增加，接近假手術組水平，提示梓醇可誘導突觸重構，增加突觸連接點數目及突觸連接面。這有助于神經環路修復過程中功能性神經連接的重建。

綜上，本研究結果表明，梓醇可促進缺血性腦卒中大鼠PIC區芽生軸突形成新的突觸連接，增強突觸新生能力，誘導突觸重構，為合理闡釋梓醇促卒中后神經修復作用及機制提供了較為直觀的形態學依據，并為卒中后促神經修復藥物研發提供了理想的候選。

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