ZNF300基因在肝癌耐藥細胞HepG2/VCR中的表達及功能初探

李 靜，王 濤

(安徽醫科大學基礎醫學院1.機能實驗中心、2.病理生理學教研室，安徽合肥 230032)

目前原發性肝癌在世界范圍內發病率居各種惡性腫瘤的第6位，致死率居第3位。由于肝癌早期診斷率較低，系統化療仍是進展期肝癌病人的主要臨床治療手段［1-2］。但是肝癌病人對化療藥物的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)成為臨床治療的一大障礙［3-4］。MDR產生的一大重要機制是腫瘤細胞內出現了耐藥基因MDR-1的高表達。MDR-1基因編碼的蛋白質產物為P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，它發揮的主要功能是將進入腫瘤細胞內的化療藥物泵出細胞外，降低藥物的作用效率，并可以抑制 caspase的活性，減少腫瘤細胞的凋亡率［3-4］。目前許多研究組致力于P-gp抑制劑的研究工作［5-6］。然而這些研究并不能解決肝癌臨床治療的根本問題，因為許多促進腫瘤發生發展的基因，如NF-κB、ERK和HIF-1等，一方面促進肝癌細胞的增殖或抑制其凋亡，另一方面可以上調P-gp的表達促進肝癌的多藥耐藥性［7-9］。因此單一用藥無法完全逆轉肝癌的MDR，尋找新的藥物作用靶點成為目前研究的熱點。

ZNF300基因是一種與人胚胎發育相關的KRAB類鋅指蛋白基因［10］，本課題組在前期研究中發現ZNF300基因在肝癌和其他腫瘤，如結腸癌和肺癌等多種腫瘤組織中高表達，而在癌旁組織中無明顯表達;進一步研究發現，ZNF300基因的過表達可以通過上調NF-κB的活性，促進ERK的磷酸化，抑制p21、p27的表達，促進腫瘤細胞的增殖和轉移;通過反義cDNA的轉染抑制ZNF300的表達則出現相反的效果［11-12］。由于NF-κB和ERK都可以通過上調 P-gp的高表達促進肝癌的 MDR，為觀察ZNF300基因能否作為逆轉肝癌多藥耐藥的候選藥物作用靶點，在本項目中，我們擬通過體外低濃度梯度遞增法構建 HepG2/VCR耐藥細胞株，檢測HepG2/VCR與普通HepG2細胞中的ZNF300基因與P-gp的表達差異，分析ZNF300基因與肝癌MDR的相關性;并在HepG2/VCR細胞中轉染ZNF300正向或反義cDNA質粒，觀察ZNF300表達上調或下調后，HepG2/VCR細胞中 P-gp的表達變化，及HepG2/VCR細胞IC50值的變化，初步分析ZNF300基因在肝癌MDR中的相關功能。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體人肝癌細胞株HepG2購自中科院上海細胞庫;DMEM高糖培養基購自Gibco公司;胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)購自杭州四季青公司;長春新堿(vincristine，VCR)購自合肥華澤生物有限公司;四甲基偶氮唑鹽〔3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3， 5-di-phenytetrazo liumromide，MTT〕購自Sigma公司;小鼠抗人P-gp單克隆抗體購自Cell Signaling公司;小鼠抗人GAPDH抗體購自上海康成公司;兔抗人ZNF300多克隆抗體為武漢大學生命科學學院李文鑫教授饋贈;辣根過氧化物酶標記羊抗鼠第二抗體購自合肥華澤生物有限公司;ECL顯影試劑盒購自Pierce公司;預染蛋白分子量Marker購自Fermentas公司;PVDF膜購自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及 HepG2/VCR的構建 HepG2細胞轉于含10%FBS的DMEM完全培養基中，在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養，每周傳代2-3次，取對數生長期的細胞用于試驗。肝癌多藥耐藥細胞株HepG2/VCR的建立采用長春新堿(VCR)低濃度梯度遞增誘導法［13］，直至HepG2/VCR細胞能在含VCR 1 mg·L-1的培養液中維持生長，并利用MTT法檢測其耐藥性。

1.2.2 HepG2/VCR耐藥性的鑒定 為鑒定HepG2/VCR的耐藥性，將 HepG2/VCR和普通HepG2細胞培養至指數生長期后，按5×103個細胞/孔接種于96孔板，培養24 h后，加入不同濃度VCR(0.01、0.1、1、10 和100 mg·L-1)處理24 h，進行MTT檢測，繪制生長曲線。

1.2.3 質粒構建和轉染 正向和反向ZNF300基因cDNA克隆入IRES-GFP真核表達質粒中，分別命名為 IRES-ZNF300-GFP和 IRES-ASZNF300-GFP，克隆方法見參考文獻［12］。用Lipofectamine 2000轉染試劑將IRES-ZNF300-GFP和IRES-ASZNF300-GFP及其對照質粒IRES-GFP轉染入HepG2/VCR細胞中，轉染方法為:將HepG2/VCR細胞按5×105個細胞/孔接種于6孔板，在含5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養，直至轉染前細胞密度達到80% ～90%;按轉染試劑說明書配制轉染復合物(Lipofectamine 2000):在250 μl Opti-MEM 中加入10 μl轉染試劑;質粒復合物:在250 μl Opti-MEM中加入4 μg質粒;室溫靜置5 min后將質粒復合物加入轉染試劑復合物中，使之形成DNA-脂質體復合物，室溫靜置20 min，每孔細胞中加入1.5 ml無血清無雙抗DMEM培養液，將DNA-脂質體復合物輕輕混勻加入細胞中，在含5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養5 h后;將每孔細胞更換成2 ml有血清的DMEM培養液。轉染24 h后進行后續實驗。

1.2.4 Western blot檢測 Western blot方法用于檢測HepG2/VCR和普通HepG2細胞中ZNF300和P-gp蛋白質的表達差異，及HepG2/VCR質粒轉染后ZNF300和P-gp蛋白質的表達變化。收取經上述細胞，用含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、氟化鈉和釩酸鈉的加樣緩沖液冰上靜置裂解細胞10 min，再100℃變性10 min即為全細胞裂解液，SDS-PAGE凝膠電泳后冰浴濕式轉印至PVDF膜，參數為恒壓80V ×3 h.用含 0.5 g·L-1脫脂奶粉和 0.5 ml吐溫20的PBST封閉30 min后，按抗體廠家建議稀釋一抗后4℃敷膜結合過夜，待檢測抗體為ZNF300多克隆抗體和P-gp單克隆抗體，以GAPDH抗體為內參。一抗結合后PBS-T洗膜10 min×3次，加入適當稀釋度的二抗，室溫揺床結合2 h，再次PBS-T洗膜10 min×3次，暗室內ECL顯色，柯達膠片感光顯影并掃描。

1.2.5 MTT檢測及IC50值計算 HepG2/VCR細胞按5×103個細胞/孔接種于6孔板，進行ZNF300相關質粒轉染后48 h，用0.25%胰酶消化重懸，按5×103個細胞/孔接種于96孔板，24 h后加入不同濃度VCR(0.125、0.25、0.5、1和2mg·L-1)干預 24 h，在終止培養前4 h加MTT溶液(0.5 mg·L-1)。培養結束后棄上清，每孔加入100 μl DMSO，置于搖床上15 min，使結晶物充分溶解;置酶標儀上檢測各孔吸光度值(A570nm)，實驗至少重復3次。根據MTT結果繪制生長曲線，并采用中效分析軟件(Logit法)計算質粒轉染后，HepG2/VCR細胞對VCR的半數抑制濃度值(50%inhibitory concent ration，IC50)變化，按以下公式計算耐藥指數(resistance index，RI)。RI=IC50質粒轉染后的細胞/IC50親本細胞。

1.2.6 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件對實驗數據進行分析，計量資料以±s表示，組間數據的顯著性檢驗采用ANOVA法分析。

2 結果

2.1 肝癌耐藥細胞株HepG2/VCR耐藥性的鑒定篩選出的HepG2/VCR細胞和HepG2細胞在其指數生長期時，分別加入不同濃度 VCR(0.01、0.1、1、10和100 mg·L-1)處理24 h，經MTT檢測后繪制生長曲線后發現，HepG2/VCR細胞對VCR的耐藥性相對于 HepG2細胞明顯增高(P＜0.05，ANVOA)(Fig 1)，說明肝癌耐藥細胞株HepG2/VCR構建成功。

Fig 1 MTT analysis of HepG2/VCR and HepG2 treated with different concentrations of VCR

2.2 Western blot檢測發現HepG2/VCR細胞中ZNF300和P-gp表達增高HepG2/VCR細胞和HepG2細胞在其指數生長期時收取蛋白質，進行Western blot檢測，樣品各點兩道，用兔抗人ZNF300多克隆抗體和鼠抗人P-gp單克隆抗體進行檢測，以GAPDH作為內參，結果如Fig 2所示，可見在GAPDH表達基本一致的情況下，HepG2/VCR細胞中ZNF300和P-gp的表達明顯高于HepG2細胞，提示ZNF300基因與HepG2/VCR細胞的耐藥性和P-gp的表達有相關性。

2.3 ZNF300基因表達變化對HepG2/VCR細胞中P-gp表達及耐藥性的影響在HepG2/VCR細胞中轉染，將IRES-ZNF300-GFP和IRES-ASZNF300-GFP及其對照質粒IRES-GFP，轉染后48 h，收取蛋白質，用兔抗人ZNF300多克隆抗體和鼠抗人P-gp單克隆抗體進行Western blot檢測，以GAPDH作為內參，結果如Fig 3所示，可見在GAPDH表達基本一致的情況下，IRES-ZNF300-GFP組細胞中ZNF300和P-gp表達明顯高于空載體組和親本細胞組，IRES-ASZNF300-GFP組細胞中結果相反，說明質粒轉染后可有效促進ZNF300在細胞中的高表達或Knockdown，ZNF300高表達可上調 P-gp的表達，ZNF300基因knockdown則可抑制P-gp的表達。質粒轉染后，加入不同濃度 VCR(0.125、0.25、0.5、1和2 mg·L-1)干預24 h行MTT檢測繪制生長曲線(Fig 4)，并計算 IC50值和 RI值變化(Tab 1)，可見ZNF300基因高表達可促進HepG2/VCR的耐藥性，而ZNF300基因Knockdown則有相反的結果(P＜0.05)。說明ZNF300基因可以通過上調P-gp的表達促進HepG2/VCR的耐藥性。

Tab 1 Drug resistance of HepG2/VCR improved by ZNF300 overexpression

Fig 4 Drug resistance of HepG2/VCR cells promoted by ZNF300 overexpression

3 討論

對于原發性肝癌，有效的臨床治療手段在于早期診斷和手術切除原發病灶，但是目前臨床上確診的大多數肝癌病人已處于進展期，所以系統化療仍是目前肝癌臨床治療的主要手段［1-2］。然而肝癌病人對傳統化療藥物均會出現多藥耐藥(MDR)現象，所以肝癌病人的預后往往極為不好［3-4］。近年來隨著分子靶向藥物的研究進展，以Sorafenib為代表的一些藥物被批準上市，給肝癌的臨床治療帶來新的希望，然而現在發現病人同樣會對Sorafenib產生耐藥性［3］。所以對于肝癌MDR逆轉藥物或藥物作用靶點的研究成為目前的研究熱點。

現在認為肝癌MDR產生的一個最主要的機制在于 MDR-1基因產物 P-糖蛋白(P-gp)的高表達［4］。P-gp是一個170 ku大小的蛋白質成分，表達于腫瘤細胞的細胞膜，屬于ATP結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter)家族成員，主要功能在于將進入細胞的藥物泵出細胞外以達到減少藥物對細胞毒性的目的［4］。在本項目中，我們采用長春新堿(VCR)低濃度梯度遞增誘導法建立HepG2/VCR耐藥細胞株，通過MTT檢測確定其構建成功，經Western blot檢測后發現，HepG2/VCR細胞中的P-gp表達水平明顯高于HepG2細胞，這與前期研究報道相符［13］。

然而目前許多抑制P-gp表達的藥物并不能根本解決肝癌MDR的實際問題，因為肝癌MDR的產生是一個多因素參與的過程，現在發現許多促進腫瘤發生發展的基因，如NF-κB和ERK，一方面可以抑制腫瘤細胞凋亡，另一方面亦可上調P-gp的表達，在肝癌 MDR的產生過程中發揮重要的作用［4，7-8］。所以尋找新的藥物作用靶點與P-gp抑制劑共同作用來逆轉MDR成為一種新的策略。

ZNF300基因最初是從人胚胎cDNA文庫中篩選出來的一種KRAB類鋅指蛋白基因，前期研究發現其KRAB區可以發揮轉錄抑制作用，其鋅指區可以結合CG富含的啟動子區域［10-12］。本課題組前期研究發現ZNF300基因可以通過調控TRAF2基因的表達，同時結合IKKβ蛋白質來促進NF-κB通路的活性，進一步研究發現ZNF300高表達可以促進ERK的磷酸化，從而促進腫瘤細胞的增殖和轉移，而NF-κB和ERK都可上調 P-gp的表達［12］。利用免疫組織化學檢測我們發現ZNF300基因在肝癌等多種腫瘤組織細胞中高表達，而在癌旁組織中表達較低［12］。綜合上述研究基礎，在本項目中，我們利用Western blot檢測發現HepG2/VCR細胞中ZNF300的表達明顯高于HepG2細胞，并與P-gp的表達有相關性，提示ZNF300基因可能參與肝癌MDR的形成過程。在進一步的實驗中，我們將正向和反向ZNF300基因cDNA轉染入HepG2/VCR細胞中，經Western blot檢測發現正向cDNA的轉染可以明顯促進ZNF300的表達，并上調P-gp在HepG2/VCR中的表達，MTT檢測發現ZNF300基因高表達可以促進HepG2/VCR的耐藥性。而反向ZNF300基因cDNA則有完全相反的結果。

上述實驗結果說明ZNF300基因在肝癌耐藥細胞株中高表達，并可以通過上調耐藥基因P-gp的表達促進肝癌的多藥耐藥性，初步證明ZNF300可以作為逆轉肝癌MDR的潛在藥物作用靶點。而ZNF300基因在肝癌MDR發生發展過程中的發揮作用的具體機制尚待進一步研究。

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