地塞米松的誘導效應對異煙肼大鼠肝毒性的影響

王來友，陳玲燕，程 寶，畢惠嫦，胡因銘

(1.廣東藥學院中醫藥研究院，廣東廣州 510006;2.中山大學臨床藥理研究所，廣東 廣州 510006)

利福平(rifampicin，RIF)與異煙肼(isoniazid，INH)均是臨床上預防和治療結核的一線藥物，通常需聯合應用，但也引起諸多不良反應，其中肝毒性最為嚴重。INH在與RIF合用的情況下，其肝損傷發生率明顯增加，部分調查顯示可達28%［1］。INH所引起的肝損傷為細胞毒性，其發生原因復雜，迄今對其確切的發生機制尚無明確認識［2］。最近，研究者們發現人肝臟藥物代謝酶CYP3A4與INH導致的肝細胞毒性有關 。在過表達CYP3A4的HepG2細胞體系中，用 0.1 － 100 μmol·L－1INH 處理后，相對于對照組，細胞存活率明顯下降，但加入CYP3A4抑制劑酮康唑后，細胞存活率又恢復至空白對照組水平［3］。Yoshikawa 等［4］的實驗也進一步證實了CYP3A4可以明顯介導INH產生的細胞毒性。另有報道RIF可以增加INH對人肝細胞的毒性，但是不能增加對大鼠肝細胞的毒性［5］。迄今國內外尚未獲得CYP3A參與INH肝毒性的體內證據。

RIF是肝微粒體代謝酶的誘導劑，可強烈的激活人孕烷X受體(human pregnane X receptor，hPXR)。但PXR有很強的種族特異性，RIF對hPXR有特異性激活作用，對嚙齒類動物PXR的激活作用相當弱或無［6］。因而本實驗用大鼠的特異性PXR激活劑地塞米松(dexamethasone，DEX)代替hPXR激活劑RIF，為臨床上抗結核藥物RIF-INH聯合應用所導致的肝損傷提供動物模型，并探討CYP3A在其中的意義，為進一步的深入機制研究和防治策略提供依據。

1 材料

1.1 藥物及試劑DEX購自美國Alfa Aesar(天津)化學有限公司，INH、咪達唑侖購自美國Sigma-Aldrich公司，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸轉移酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒購自北京利德曼生化股份有限公司，總膽固醇(TC)和總甘油三酯(TG)測定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司;大鼠肝微粒體蛋白酶抑制劑購自Thermo Scientific公司，氯化鈉、無水乙醇、甲醛、K2HPO4、KH2PO4等購自廣州化工試劑廠，為分析純。

1.2 實驗儀器切片機(浙江寶華無線電廠);YD-bL智能型生物細胞包埋機冷凍臺、KD-BMⅡ電腦生物細胞包埋機、KD-TS1生物細胞自動脫水機(浙江省寶華市科迪儀器設備有限公司);奧林巴斯IX71倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，TSQ-Quantum型液相色譜－質譜儀(美國Finnigan公司)。

1.3 實驗動物與飼料SPF級 Sprague-Dawley(SD)♂大鼠，270～300 g，廣東省醫學實驗動物中心提供〔SCXK(粵)2008-0002〕。含DEX飼料由廣東省醫學實驗動物中心提供并加工:將160 mg DEX均勻地混合在8 kg大鼠飼料中，加工至每公斤大鼠飼料含DEX 20 mg，鈷輻照滅菌，SPF級包裝。1 000 mg·L－1INH溶液的配制:用電子分析天平精確稱取1g INH，用1 000 ml高壓滅菌水配制成1 000 mg·L－1INH溶液。分裝于500 ml飲用水瓶中，備用。

2 方法

2.1 實驗分組、給藥劑量及給藥途徑24只♂SD大鼠按體重隨機分成4組，每組6只，單籠喂養。分別按每日 0.5 mg·kg－1和 50 mg·kg－1灌胃給藥劑量配備相應的DEX飼料和INH飲用水。具體給藥方式及途徑如下:(1)空白對照組:給予普通飼料和空白飲用水;(2)DEX對照組:給予含DEX的飼料和空白飲用水;(3)INH組:給予普通飼料和含INH的飲用水;(4)DEX-INH組:給予含DEX的飼料和含INH的飲用水。于SPF級環境飼養28 d，動物室內溫度20℃ ～25℃、相對濕度40% ～70%，換氣次數10～15次/h，保持12 h光照循環。

2.2 肝組織病理形態學檢查實驗前禁食12 h，可自由飲用不含INH的普通水。頸椎脫臼處死大鼠后立即開腹，取出肝臟，用刀片在肝臟最大葉距離邊緣1/5處取出寬約3 mm，長約2 cm的肝臟組織，立即放入10%中性福爾馬林中。10 d后取出肝臟組織，經取材、固定、組織脫水、透明、浸臘、包埋、切片、裱片及烤片、HE染色、封片等程序后，對各組大鼠的肝臟組織切片進行圖像采集，并用Image-Pro Plus 6.0軟件對組織中的特征病變區域面積進行統計，采用按點計數方式評估肝損傷的嚴重程度［7］。

2.3 CYP3A活性測定采用差速超速離心法制備肝微粒體。取實驗后冷凍保存的肝樣品稱重后，用冰冷的蔗糖溶液洗滌后，轉移至塑料管中。每100 mg肝加入含蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液(320 mmol·L－1蔗糖，50 mmol·L－1KH2PO4，1 mmol·L－1EDTA)600 μl，上下均勻移動塑料管20 s，避免泡沫產生，制備勻漿，4℃下9 000×g離心20 min，取上清液，100 000 ×g，4℃下離心 60 min，棄上清。下層沉淀潤洗后，重新混懸于含冰凍緩溶液(100 mmol·L－1K2HPO4/KH2PO4，20%(V/V)甘油，1 mmol·L－1EDTA)中，混勻，分裝成兩份，－80℃ 凍存備用，分別用于總蛋白含量測定和CYP3A1/2活性檢測。BCA法測定肝微粒體蛋白質濃度。參考實驗室已經建立的方法，咪達唑侖用作測定CYP3A活性的探針藥物［8］。即分別用制備的不同組的含0.25 g·L－1大鼠肝微粒體在200 μl體系中于37℃體外預孵育 5 min 后，加入 20 mmol·L－1NADPH 10 μl啟動反應，輕搖30 min后加入冰冷的乙腈200 μl終止反應。旋渦振蕩2 min，靜置10 min，20 000 × g離心10 min，取上清液進樣10 μl，LC-MS檢測咪達唑侖代謝產物1’-羥基咪達唑侖的含量。

2.4 血清中各種生化指標的檢測在從大鼠取肝組織前，眼眶靜脈叢采血約2 ml，1 000×g離心5 min。實驗時，取出200 μl血清，采用日立7020全自動生化分析儀按照試劑盒測定血清中ALT、AST和ALP水平以及TC和TG的濃度。

2.5 統計學處理實驗數據用±s表示，應用SPSS 17.0軟件包進行方差分析，組間比較采用Dunett t檢驗方法進行顯著性檢驗。

3 結果

3.1 肝組織病理形態學檢查如代表性肝組織切片Fig 1所示，6只對照組大鼠肝臟結構正常，肝小葉清晰可見，肝細胞排列較整齊，匯管區未見膽管增生，未見炎細胞浸潤;INH組(5/6)大鼠肝部分區域(25.6% ±4.2%)區域發生輕微水腫(黑色箭頭所示)，其余結構未見異常;DEX組大鼠匯管區膽管輕微增生(3.2% ±1.5%)，均出現局灶性肝細胞梗死(7.4% ±2.3%)，如Fig 1 DEX中黑色五角星所示。INH-DEX合并給藥后，1只大鼠在d 20出現死亡，其余5只大鼠均出現大片狀程度不一的肝細胞(71.2% ±13.6%)梗死(如五角星所示)，梗死區周圍較多肝細胞(40.1% ±11.8%)水腫(如箭頭所示)，肝臟損傷程度明顯加劇，肝損傷分值明顯高于對照組和INH組(P＜0.01)，提示肝臟損傷程度明顯加劇。

Fig 1 Representative liver section of rats treated with DEX-containing diet(20 mg·kg－1，W/W)and INH-containing water(1000 mg·L－1，W/V)for 28 days(HE ×200)

3.2 肝指數與CYP3A活性如Tab 1所示，服用INH后，大鼠肝臟指數與CYP3A活性與對照組相比無明顯變化。但服用DEX后，與對照組相比其肝指數明顯增加，CYP3A活性增加了2.58倍(P＜0.01)。而 DEX與 INH合用組，其肝臟指數與CYP3A活性與 DEX組差別不明顯(P＞0.05)，CYP3A活性與對照組相比增加了近3倍(P＜0.01)。因此可以看出，與對照組相比，DEX與INH合用后其增加的肝臟指數與CYP3A活性主要來自于DEX。

Tab 1 Liver index and relative hepatic CYP3A activity in rats treated with DEX-containing diet(20 mg·kg－1，W/W)and INH-containing water(1 000 mg·L－1，W/V)for 28 days( ± s，n=5 ～ 6)

Tab 1 Liver index and relative hepatic CYP3A activity in rats treated with DEX-containing diet(20 mg·kg－1，W/W)and INH-containing water(1 000 mg·L－1，W/V)for 28 days( ± s，n=5 ～ 6)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group Liver index CYP3A relative activity Control 3.84 ±0.06 1.00 ±0.15 INH 3.95 ±0.07 1.19 ±0.18 DEX 5.26 ±0.09＊＊ 2.58 ±0.42＊＊DEX+INH 5.65 ±0.23＊＊ 2.99 ±0.45＊＊

3.3 血清生化檢測結果如Tab 2所示，飲用含1 000 mg·L－1INH的水28 d，大鼠血清中 AST和ALP水平均無明顯變化(P＞0.05)，ALT略有升高，但TC和TG均明顯升高(P＜0.05)，表明長期單用INH能增加大鼠的脂質水平。服用DEX后，其ALT和TC均有升高(P＜0.05)，而AST、ALP和TG水平明顯增加(P＜0.01)。DEX-INH兩藥合用后，血清中所檢測的ALT、AST、ALT、TC和TG五項指標均明顯上升(P＜0.01)，與對照組相比，其肝細胞損傷指標ALT上升了3.7倍，AST上升了2.7倍，與肝組織切片觀察的結果相一致。而與INH組相比，除TG水平有上升外(P＜0.05)，其它4項指標差異均有顯著性(P＜0.01)。

4 討論

抗結核藥物所導致的肝損傷一直是臨床上結核患者依從性較差的主要原因。到目前為止，尚沒有能完全模擬臨床實際情況的整體動物模型，其主要原因還是在于種屬差異性，也給進一步的機制和防治策略研究帶來障礙。一些學者認為INH的肝毒性與N-乙酰基轉移酶(NAT)和CYP2E1介導產生的毒性中間產物有關。其毒性代謝產物推測為肼(hydrazine)和乙酰肼(acetylhydrazine)［9］。然而分別用這兩種代謝產物100 mg·kg－1的劑量處理C57BL/6小鼠時，卻并不發生明顯的藥物性肝損傷［10］。而本實驗中，用大鼠的特異性PXR激活劑DEX后，CYP3A的活性明顯增加，同時也明顯增強了INH的肝毒性，表明 CYP3A可能與臨床上RIFINH合用所導致的肝毒性有關。張志華等［11］利用人肝細胞模型發現，葡萄柚汁中的CYP3A4抑制劑柑桔素能明顯減輕INH和RIF合用的肝細胞毒性，進一步提示對CYP3A活性進行調節可能對防治RIF-INH所導致的肝損傷具有重要意義，但仍需更直接的體內證據進一步提供支持。

本實驗利用含DEX的飼料和含INH的水自然給藥的方式。預實驗結果表明，一只280 g左右的SD大鼠大約日消耗15 g左右的飼料和30 ml左右的飲用水，利用率均為50%左右。因而我們用的含20 mg·kg－1DEX的飼料近似于灌胃給藥的等效劑量為 0.5 mg·kg－1，含 1 000 mg·L－1INH 的水近似于灌胃給藥的等效劑量為50 mg·kg－1。

在我們檢測的血清學指標中，DEX的使用均導致AST/ALT＞1，提示肝細胞線粒體損傷嚴重。然而，有研究提示DEX能通過抑制氧化應激對非甾體抗炎藥雙氯芬酸鈉的肝損傷有保護作用［12］，造成這種相反結果的原因可能與DEX應用的時程和DEX能同時激活糖皮質激素受體等其它靶點相關。另外，在我們復制的DEX-INH導致的大鼠慢性肝毒性模型中，除觀察到肝損傷的指標ALT、AST和ALP在DEX于INH合并后明顯提高外，其脂質水平TC和TG也有明顯提高。已有研究報道RIF會導致臨床上的高脂血癥［13］，最新的研究也表明INH能使小鼠血清脂質水平升高［14］。有報道RIF-INH的合用產生的肝損傷可能與其升高的脂質導致脂質過氧化物的增加有關［15］。結合上述研究結果，“降脂調肝”策略可能是防治抗結核藥物性肝損傷的一個新的選擇。

Tab 2 Effect of INH，DEX and INH-DEX treatment on serum ALT，AST，ALP，TC and TG level in rats(±s，n=5－6)

Tab 2 Effect of INH，DEX and INH-DEX treatment on serum ALT，AST，ALP，TC and TG level in rats(±s，n=5－6)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs INH group

Group ALT/U·L－1 AST/U·L－1 ALP/U·L－1 TC/mmol·L－1 TG/mmol·L －1 Control 69.0 ±8.7 120.1 ±11.4 99.1 ±18.6 2.29 ±0.42 0.88 ±0.22 INH 74.7 ±9.1 110.7 ±16.8 95.7 ±14.9 4.10 ±0.58* 1.68 ±0.36*DEX 99.6 ±9.7* 208.0 ±18.8＊＊ 170.2 ±19.3＊＊ 4.15 ±0.66* 1.96 ±0.21＊＊DEX+INH 256.1 ±32.2＊＊△△ 325.3 ±29.8＊＊△△ 256.9 ±21.7＊＊△△ 8.32 ±0.98＊＊△△ 2.68 ±0.35＊＊△

綜上所述，含 DEX 20 mg·kg－1的飼料和含1 000 mg·L－1INH的水喂養28 d后的大鼠能明顯地出現肝損傷，其機制可能與DEX上調CYP3A活性或增加的脂質過氧化物有關。因而，選擇性的CYP3A抑制劑柑桔素或抗氧化類的降脂藥物如普羅布考或許對其有保護作用，但尚需進一步的體內實驗證據支持，以帶給臨床上RIF-INH所致肝損傷結核患者直接的臨床獲益。

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