內皮－單核細胞激活多肽對人U118膠質瘤細胞自噬的影響及機制

劉麗波，孟繁杰，薛一雪，劉云會

(1.中國醫科大學基礎醫學院神經生物學教研室，遼寧沈陽 110001;2.中國醫科大學附屬盛京醫院神經外科，遼寧 沈陽 110004)

腦膠質瘤是惡性程度很高的原發性顱內腫瘤，約占中樞神經系統腫瘤的60%。腦膠質瘤患者雖經手術、放療及化療等多種治療手段的干預，但死亡率仍高達98%以上，因此提高療效，延長患者的生存期成為亟待解決的一大難題［1］。內皮-單核細胞激活多肽Ⅱ(endothelial monocyte activating polypeptideⅡ，EMAP-Ⅱ)是從甲基膽蒽A誘導形成的纖維肉瘤細胞的培養液中發現的，具有促進細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成的特性［2］。研究顯示，EMAP-Ⅱ能夠抑制多種原發性和繼發性腫瘤的生長、增殖和侵襲，因而被廣泛應用于抗腫瘤治療的研究［3］。自噬(又稱為Ⅱ型程序性死亡)是廣泛存在于真核細胞中的生命現象，是利用溶酶體清除受損細胞器及異常蛋白質的過程，與細胞穩態的維持和疾病的發生密切相關。在腫瘤的發生過程中，自噬通過影響細胞周期、調節腫瘤細胞的凋亡以及調控腫瘤血管生成等方面參與腫瘤的發生與發展［4］。但EMAP-Ⅱ是否通過誘導腫瘤細胞自噬發揮抑制腫瘤細胞增殖，尚不清楚。本研究擬以人U118膠質瘤細胞為研究對象，觀察EMAP-Ⅱ對自噬標志蛋白LC3、自噬降解底物p62/SQSTM1和自噬相關蛋白Beclin1表達水平的影響，探討 EMAP-Ⅱ抑制人U118細胞活力及誘導自噬的作用效果及可能機制，為EMAP-Ⅱ的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器EMAP-Ⅱ (PeproTech公司);MTT、3-MA(Sigma公司);DMEM細胞培養液(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);兔抗LC3多克隆抗體、小鼠抗p62/SQSTM1單克隆抗體和兔抗Beclin1多克隆抗體(Abcam公司);小鼠抗GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗、TRITC標記的二抗和ECL化學發光檢測試劑盒(Santa Cruz公司)。主要儀器:多功能酶標儀(Molecular Devices，美國)，正置顯微鏡(Olympus，日本)，電泳裝置(Bio-Rad，美國)。

1.2 細胞培養人U118神經膠質瘤細胞株由中國醫科大學神經生物學教研室保存。用高糖DMEM培養基加10%胎牛血清培養U118細胞，置37℃、5%CO2培養，2～3 d傳代1次。取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞活力測定細胞活力采用MTT方法檢測。制備U118細胞懸液，以每孔100 μl含1×104細胞數接種于96孔板，培養24 h后對照組(DMEM培養液)和不同濃度的 EMAP-Ⅱ (0.005、0.05和0.5 nmol·L－1)組分別作用0.5、1、2、3和6h，而后終止反應，棄去培養液，加入0.5 g·L－1的 MTT溶液孵育4 h，棄去液體，加入100 μl DMSO振蕩溶解10 min，使結晶充分溶解，酶標儀測定490 nm波長處各孔光吸收值。實驗重復8次。

1.4 流式細胞術檢測線粒體膜電位取對數生長期的U118細胞，分組給藥后，收集5×105個細胞，用PBS洗滌2次，取500 μl JC-1工作液將細胞均勻懸浮，37℃，5%CO2培養箱中孵育 20 min，收集細胞，用1×孵育緩沖液洗滌2次，用500 μl的1×孵育緩沖液重新懸浮細胞。用流式細胞儀檢測，綠色熒光通過通道FL1檢測，紅色熒光通過通道FL2檢測。JC-1的聚集依賴于線粒體的膜電位，在線粒體膜電位較高時，JC-1以多聚體的形式聚集在線粒體內發紅色熒光;當線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集到線粒體內，以單體形式存在于胞質內發綠色熒光。

1.5 免疫熒光法檢測LC3的表達和分布4%多聚甲醛固定EMAP-Ⅱ作用不同時間的生長在蓋玻片上的U118細胞，PBS漂洗后用10%BSA封閉30 min，兔抗LC3一抗反應過夜(陰性對照用0.01 mol·L－1的PBS代替一抗)，PBS清洗后用TRITC標記的二抗避光條件下反應30 min，甘油封片，在熒光顯微鏡下，用激發波長為565 nm的濾光片進行觀察，采集圖像。

1.6 Western blot實驗收集EMAP-Ⅱ作用不同時間的人U118膠質瘤細胞，加入RIPA裂解液(10 g ·L－1aprotinin，10 g·L－1PMSF 和50 mmol·L－1sodium orthovanadate)。采用考馬斯亮藍G250結合法測定細胞提取物的蛋白濃度，以每加樣孔10～20 μg蛋白總量經SDS-PAGE電泳進行分離，并轉移至PVDF膜，于4℃用5%脫脂奶粉封閉過夜。分別加入LC3、p62/SQSTM1、Beclin1和 GAPDH 的一抗室溫2 h，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫2 h后，向膜上滴加ECL工作液，進行壓片曝光，顯影定影，用Chemi Imager 5500 V2.0軟件掃描獲取圖像，通過Fluor Chen 2.0軟件進行定量分析，測得光密度值(integrated density value，IDV)。以目的蛋白與內參照GAPDH的吸光度值的比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.7 統計學處理所有數據以±s表示，采用SPSS 13.0統計學軟件進行統計學分析，兩組間采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析和Bonferroni檢驗。

2 結果

2.1 EMAP-Ⅱ對U118細胞活力的影響如Fig 1A 所示，不同濃度(0.005、0.05 和0.5 nmol·L－1)的 EMAP-Ⅱ作用于 U118 細胞0.5、1、2、3 和6 h 后，U118細胞的活力受到明顯抑制，在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時抑制效果最明顯;EMAP-Ⅱ抑制U118細胞活力的效果呈劑量依賴性，其中0.05和0.5 nmol·L－1EMAP-Ⅱ組之間沒有差異，證明0.05 nmol·L－1是EMAP-Ⅱ作用的最適劑量，因此我們選用0.05 nmol·L－1EMAP-Ⅱ進行后續實驗。

為檢測EMAP-Ⅱ是否通過誘導U118膠質瘤細胞自噬抑制其活力，應用5 mmol·L－1的3-MA預處理1 h 后給予0.05 nmol·L－1的 EMAP-Ⅱ，作用0.5 h后檢測U118細胞活力，結果顯示3-MA能夠有效阻斷EMAP-Ⅱ的作用，使細胞活力恢復(Fig 1B)。

2.2 EMAP-Ⅱ對U118細胞MMP的影響線粒體探針JC-1用于檢測細胞MMP，反映線粒體的功能。0.05 nmol·L－1的EMAP-Ⅱ作用后能夠明顯降低U118細胞的MMP，抑制線粒體功能，在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時效果最明顯;3-MA能有效阻斷EMAP-Ⅱ的作用，使U118膠質瘤細胞的MMP升高，線粒體功能恢復(Fig 2)。

Fig 1 A:Cells viability of human U118 glioma cells after treatment with 0.005，0.05 and 0.5 nmol·L－1EMAP-Ⅱ for 0.5，1，2，3 and 6 h(±s，n=8).*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs EMAP-Ⅱ0 h group values.B:Effects of 3-MA on cells viability of human U118 glioma cells after treatment with 0.05 nmol·L－1EMAP-Ⅱfor 0.5 h(±s，n=8).＊＊P＜0.01 vs EMAP-Ⅱ0 h group values;##P＜0.01 vs EMAP-Ⅱ0.5 h group values

Fig 2 Effects of EMAP-Ⅱand 3-MA on MMP of human U118 glioma cells(±s，n=5)

2.3 EMAP-Ⅱ對LC3分布和表達的影響免疫熒光染色顯示，EMAP-Ⅱ0 h組的U118細胞中，在細胞質中可見到微弱的LC3熒光表達(Fig3A)。EMAP-Ⅱ作用后，LC3的表達明顯上調(Fig 3B)，呈點狀分布在細胞質中。Western blot實驗結果也證實，EMAP-Ⅱ作用能夠明顯增加 LC3-Ⅱ的表達，在0.5 h時達峰值(Fig 4)。

Fig 3 Expression and distribution of LC3 analyzed by immunofluorescence assay after treatment with EMAP-Ⅱin human U118 glioma cells for 0.5 h

2.4 EMAP-Ⅱ作用后p62/SQSTM1和Beclin1在U118細胞中的表達EMAP-Ⅱ作用于U118細胞0.5、1、2、3 和 6 h 后，Western blot結果顯示，與EMAP-Ⅱ0 h組相比，EMAP-Ⅱ作用后自噬降解底物p62/SQSTM1的蛋白表達水平明顯下降，而自噬相關蛋白Beclin1的蛋白表達水平則明顯增加，二者均在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時變化最明顯(Fig 5)。

3 討論

目前對于腦膠質瘤的治療，特別對于惡性或高級別膠質瘤的治療，即使采取綜合治療仍然很難達到長期控制腫瘤。化療是膠質瘤綜合治療的重要環節，可提高患者生活質量，延長平均中位生存期和無效進展期。近年研究發現，化療可以誘導膠質瘤細胞產生自噬，并參與了自噬的分子調控［5］。目前，調節自噬反應已經成為包括膠質瘤在內的多種癌癥治療的新靶點，對自噬調節機制的深入研究可能為腦膠質瘤的治療提供新的有效途徑。

本研究中，我們應用MTT法檢測發現，EMAP-Ⅱ能夠明顯降低人U118膠質瘤細胞的活力，在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時效果最明顯，隨著作用時間延長細胞活力逐漸恢復。為探討EMAP-Ⅱ作用能快速降低人U118細胞活力的原因，我們檢測了EMAP-Ⅱ對人U118膠質瘤細胞的MMP的影響，結果顯示EMAP-Ⅱ作用0.5 h即能有效降低U118細胞的MMP，抑制線粒體功能，隨著作用時間的延長MMP逐漸恢復;上述結果顯示EMAP-Ⅱ能通過抑制線粒體功能影響人U118膠質瘤細胞的活力，隨著EMAP-Ⅱ作用時間的延長，線粒體功能的恢復，導致細胞活力得以恢復。

EMAP-Ⅱ是否通過自噬途徑抑制U118膠質瘤細胞活力，尚不清楚。LC3是檢測自噬的標志蛋白，細胞內存在兩種形式的LC3蛋白:LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ，分布于胞質中;當自體吞噬發生時，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺偶聯形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體內膜和外膜，并且LC3-Ⅱ始終穩定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來做為自噬體的標記，而且LC3-Ⅱ的水平在某種程度上反映了自噬體的數量［6］。我們的研究結果顯示，EMAP-Ⅱ作用后人U118膠質瘤細胞內的點狀聚集明顯增多，并且 LC3-Ⅱ的蛋白表達水平明顯上調，在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時上調最明顯。同時，Western blot結果顯示，EMAP-Ⅱ能夠降低U118細胞 p62/SQSTM1的蛋白表達，其變化趨勢與LC3-Ⅱ的趨勢相一致。p62/SQSTM1被認為是泛素化蛋白聚集體和自噬復合物之間的接頭蛋白，可與LC3結合定位于自噬體，作為自噬的一個選擇性降解底物，最終能被自噬溶酶體系統降解［7］。因此，p62/SQSTM1的表達也可以作為檢測自噬的一個指標。上述結果證明，EMAP-Ⅱ可通過誘導人U118膠質瘤細胞的自噬，進而抑制細胞活力，但具體機制需要深入研究。

Beclin1是第一個確定的哺乳動物自噬蛋白，能夠與Vps34 PI3K(Ⅲ型)、紫外線照射耐藥相關基因等形成蛋白復合物，參與自噬體雙膜結構的形成［4］。研究證明［8］Beclin1等位基因在人類乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌缺失，并且Beclin1的缺失能夠導致小鼠腫瘤的發生，而Beclin1表達的恢復則能誘導自噬，抑制腫瘤發生發展。有報道認為［9］Beclin1也參與了腦膠質瘤的自噬反應。在本研究中，EMAP-Ⅱ作用后能夠明顯促進人U118膠質瘤細胞中Beclin1的蛋白表達水平，提示Beclin1是EMAP-Ⅱ誘導U118細胞自噬，進而抑制其活力的調節機制之一。

自噬在癌癥和治療應答中的作用很復雜，自噬既可以作為腫瘤抑制者，也可以作為癌細胞生存保護者［10］。在膠質瘤的治療中，EMAP-Ⅱ對人 U118膠質瘤細胞究竟起到怎樣的作用呢?我們應用3-MA預處理后給予EMAP-Ⅱ，檢測U118膠質瘤細胞的活力和 MMP，結果顯示3-MA能夠有效阻斷EMAP-Ⅱ抑制細胞活力和降低細胞MMP的能力，提示EMAP-Ⅱ可通過誘導細胞自噬，導致線粒體功能嚴重受損，抑制細胞活力。研究顯示自噬過程經歷的時間相對較短［11］，隨著EMAP-Ⅱ作用時間的延長，自噬減少，能夠使U118膠質瘤細胞的線粒體功能恢復，進而引起細胞活力恢復。

綜上所述，EMAP-Ⅱ能夠有效抑制人U118膠質瘤細胞的活力，降低細胞MMP，其作用機制可能與EMAP-Ⅱ上調膠質瘤細胞中自噬相關蛋白Beclin1表達，進而降低p62/SQSTM1、增加LC3-Ⅱ的表達，誘導膠質瘤細胞自噬有關。

［1］ Kuijlen J M，Bremer E，Mooij J J，et al.Review:on TRAIL for malignant glioma therapy ［J］ ?Neuropathol Appl Neurobiol，2010，36(3):168－82.

［2］ Shalak V，Guigou L，Kaminska M，et al.Characterization of p43(ARF)，a derivative of the p43 component of multiaminoacyl-tRNA synthetase complex released during apoptosis［J］.J Biol Chem，2007，282(15):10935－43.

［3］ Schwarz R E，Awasthi N，Konduri S，et al.EMAP Ⅱ-based antiangiogenic-antiendothelial in vivo combination therapy of pancreatic cancer［J］.Ann Surg Oncol，2010，17(5):1442 － 52.

［4］ Chen N，Karantza V.Autophagy as a therapeutic target in cancer［J］.Cancer Biol Ther，2011，11(2):157 －68.

［5］ Kaza N，Kohli L，Roth K A.Autophagy in brain tumors:a new target for therapeutic intervention［J］.Brain Pathol，2012，22(1):89－98.

［6］ Levine B，Yuan J.Autophagy in cell death:an innocent convict［J］?J Clin Invest，2005，115(10):2679 －88.

［7］ Wu W K，Wu Y C，Yu L，et al.Induction of autophagy by proteasome inhibitor is associated with proliferative arrest in colon cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，374(2):258－63.

［8］ Karantza-Wadsworth V，White E.Role of autophagy in breast cancer［J］.Autophagy，2007，3(6):610 －3.

［9］ Hamed H A，Yacoub A，Park M A，et al.OSU-03012 enhances Ad.7-induced GBM cell killing via ER stress and autophagy and by decreasing expression of mitochondrial protective proteins［J］.Cancer Biol Ther，2010，9(7):526 －36.

［10］虞燕霞，顧振綸，秦正紅，梁中琴.自噬激活與抗腫瘤藥物的作用［J］.中國藥理學通報，2006，22(2):137－41.

［10］ Yu Y X，Gu Z L，Qin Z H，Liang Z Q.The role of autophagy in pharmacological actions of anticancer drugs［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(2):137 －41.

［11］ Mizushima N.The pleiotropic role of autophagy:from protein metabolism to bactericide［J］.Cell Death Differ，2005，12(Suppl 2):1535－41.