碘化N-正丁基氟哌啶醇對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大的抑制作用

黃展勤，李金玉，姜紅巖，劉幸平，鄭燕珊，石剛剛

(汕頭大學醫(yī)學院藥理學教研室，廣東汕頭 515041)

心肌肥厚是高血壓、心肌梗死、瓣膜病、先天性心臟病等諸多心血管疾病的常見病變。其病理變化包括心肌細胞肥大、心肌間質(zhì)細胞增殖以及心肌細胞外基質(zhì)增加等多方面的改變，即心肌重構(gòu)。心肌肥厚是導致心力衰竭、增加猝死發(fā)生率的主要原因。心肌肥厚的產(chǎn)生除與血流動力學有關(guān)外，還與各種神經(jīng)體液因子有關(guān)，尤其是兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ(AngII)及內(nèi)皮素等。AngII具有生長因子樣作用，它是調(diào)節(jié)心肌細胞肥大的重要因素。AngII導致心肌細胞肥大是通過細胞內(nèi)復雜的信號傳導通路得以實現(xiàn)的，MAPK通路是一條重要的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，參與AngII誘導的心肌肥大反應［1］。ERK1/2是MAPK家族中的成員之一，與心肌細胞肥大關(guān)系最為密切［2］。cAMP反應元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是一核轉(zhuǎn)錄因子，可被多種細胞外刺激信號活化后發(fā)揮多種生物學效應。其中絲裂原與其受體結(jié)合后活化Ras，通過Ras-Raf-ERK1/2途徑活化 CREB［3］。有研究表明，CREB磷酸化異常在心肌肥厚基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用［4－5］。

碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)是本實驗室設(shè)計合成的專利化合物(國家發(fā)明專利號:ZL96119098.1)，前期研究已經(jīng)證明它具有良好的心血管活性，其機制可能與其阻斷心肌細胞膜鈣通道，防止鈣超載有關(guān)，對心肌缺血具有保護作用［6］。F2還可以通過影響MEK/ERK/Egr-1信號途徑對血管平滑肌細胞的增殖也具有抑制作用［7］。本研究在體外建立AngII誘導心肌肥大的細胞模型，觀察F2對心肌肥大的抑制作用，并進一步觀察AngII引起核轉(zhuǎn)錄因子ERK1/2和CREB蛋白表達變化及F2對其的影響，以探討F2抑制心肌肥大可能的作用機制，從而拓展F2的心血管活性研究，為其進一步研發(fā)提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器F2(本實驗室合成，結(jié)構(gòu)由中國科學院上海有機化學所鑒定，實驗前用0.01%DMSO溶解配成);胎牛血清(FBS)、高糖型DMEM培養(yǎng)基干粉(Gibco公司，美國)，BCA蛋白測試盒(Pierce Biotech公司，美國)，AngII(Sigma公司，美國)，兔源Actin多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，兔源 p-ERK1/2單克隆抗體、兔源ERK1/2單克隆抗體、兔源p-CREB單克隆抗體、兔源CREB單克隆抗體(Cell Signal公司，美國)、HRP標記的山羊抗兔lgG抗體(Santa Cruz公司，美國)、預染蛋白梯度Marker(Fermentas公司，美國)、ELC化學發(fā)光顯色試劑(Pierce Biotech公司，美國)、Western及IP細胞裂解液(P0013)(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-RAD公司)。

1.2 實驗分組、細胞肥大模型的建立及給藥大鼠心肌細胞株(H9C2)購自中國科學院細胞庫。H9C2心肌細胞培養(yǎng)于10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，且內(nèi)含1 ×105U·L－1青霉素、鏈霉素，置于 5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將正常培養(yǎng)的H9C2細胞從培養(yǎng)瓶中消化下來后，調(diào)整細胞密度為1×107·L－1，接種于6孔板中，用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，換用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞生長進入同步休止期，然后隨機分組干預，① Control組;② AngII組:培養(yǎng)液中含 10－7mol·L－1AngII;③ DMSO 組:培養(yǎng)液中含10－7mol·L－1AngII+10－5mol·L－1DMSO;④、⑤、⑥組分別為 F210－8mol·L－1組、F210－7mol·L－1組和 F210－6mol·L－1組:培養(yǎng)液中分別含有 10－7mol·L－1AngII+10－8、10－7和 10－6mol·L－1F2。以上各組培養(yǎng)液均含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。8～12 h更換1次培養(yǎng)液和藥物，相差顯微鏡觀察細胞狀態(tài)。

1.3 心肌細胞表面積的測定藥物處理好的心肌細胞用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)液漂洗1次，每組隨機選取10個視野，用相差顯微鏡(100×)拍照，用Image Pro Plus 6.1軟件測量細胞表面積，每個視野選5～8個細胞，隨機6次實驗。

1.4 心肌細胞蛋白含量的測定藥物作用后，用0.125%胰酶消化細胞使之脫落，用含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，500 r·min－1，離心 5 min，PBS 洗兩次，4℃，500 r·min－1，離心 5 min ，再用4℃的PBS將細胞重懸;用細胞計數(shù)儀測定細胞濃度，選取適當體積的細胞懸液，獲得106個細胞，500 r·min－1，離心 5 min，棄 PBS，加適量的 Western 及IP細胞裂解液，冰上裂解30 min，期間用移液器輕輕吹打數(shù)次。4℃，12 000 r·min－1離心 10 min，收集蛋白。以牛血清白蛋白為標準品繪制標準曲線，按照BCA法測定蛋白濃度。

1.5 Western blot檢測ERK1/2、CREB 蛋白表達按文獻方法［8］提取細胞總蛋白，進行Western blot檢測。每孔加入50 μg蛋白樣品，以10%(質(zhì)量分數(shù))SDS-PAGE凝膠電泳分離(濃縮膠80 V，分離膠100 V)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至NC膜上(100 V，70 min)，封閉，孵育一抗和二抗，ECL顯色，圖像分析系統(tǒng)分析目的蛋白條帶的光密度值。結(jié)果以β-actin標準化。

1.6 統(tǒng)計學處理實驗結(jié)果采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果以±s表示，統(tǒng)計方法為t檢驗和單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 F2抑制AngII誘導心肌細胞表面積的增大與Control組相比，AngII組心肌細胞表面積增大至2.75倍，DMSO組與AngII組心肌細胞表面積變化差異無顯著性(P ＞0.05)。F2(10－8、10－7、10－6mol·L－1)組心肌細胞表面積分別增加至2.29倍，1.99倍和1.31 倍。與 AngII組相比，F(xiàn)210－8、10－7、10－6mol·L－1組心肌細胞表面積分別減少了17%、28%和52%。F2劑量依賴的抑制AngII誘導心肌細胞表面積的增大，各濃度組之間差異有顯著性(P＜0.01)，見 Fig 1、Tab 1。

Tab 1 Inhibitory effects of F2on AngII-induced cell area enlargement in H9C2 cells( ± s，n=6)

Tab 1 Inhibitory effects of F2on AngII-induced cell area enlargement in H9C2 cells( ± s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs Control;##P ＜0.01 vs AngII;△△P ＜0.01 vs F210－8mol·L－1;▲▲P ＜0.01 vs F210－7mol·L－1

Group Relative cell area of H9C2 cell Control 1 Ang Ⅱ 2.75 ±0.38＊＊DMSO 2.70 ±0.42＊＊Ang Ⅱ +F210 －8mol·L－1 2.29 ±0.36##Ang Ⅱ +F210 －7mol·L－1 1.99 ±0.32##△△Ang Ⅱ +F210 －6mol·L－1 1.31 ±0.27##△△▲▲

2.2 F2對心肌細胞總蛋白含量的影響與Control組相比，AngII組心肌細胞蛋白含量增加，DMSO組與AngII組心肌細胞蛋白含量變化差異無顯著性(P＞0.05)。F2(10－8、10－7、10－6mol·L－1)劑量依賴的抑制AngII誘導心肌細胞蛋白含量的增加，各濃度組之間差異有顯著性(P＜0.01)，見Fig 2。

Fig 1 Inhibitory effects of F2on AngII-induced cell area enlargement in H9C2 cells(n=6)

Fig 2 Inhibitory effects of F2on AngII-induced cell total protein increasement in H9C2 cells(n=6)

2.3 F2對AngII激活ERK1/2的影響結(jié)果顯示，與Control組相比，AngII組和 DMSO+AngII組 p-ERK1/2蛋白表達均有增加(P＜0.01)，且兩組之間差異無顯著性(P＞0.05)。在AngII處理細胞1 min時，p-ERK1/2蛋白表達開始增加，5～10 min到達表達高峰，30 min下降到最高峰的50%，活化時間可持續(xù)60 min。與AngII組相比，F(xiàn)2劑量依賴的降低AngII刺激心肌細胞p-ERK1/2蛋白表達增加，各劑量組p-ERK1/2蛋白差異有顯著性(P＜0.01)，各組間ERK1/2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見 Fig 3。

Fig 3 Effects of F2on p-ERK1/2 and ERK1/2 protein in H9C2 cells after AngII treatment(n=6)

2.4 F2對AngII激活CREB蛋白表達的影響與Control組相比，AngII組和DMSO組p-CREB蛋白表達均明顯增加(P＜0.01)，AngII組和DMSO+AngII組之間差異無顯著性(P＞0.05)。與AngII組相比，F(xiàn)2劑量依賴抑制CREB的活化，各劑量組p-CREB蛋白差異有顯著性(P＜0.01)。各組間CREB蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見Fig 4。

3 討論

Fig 4 Effects of F2on p-CREB and CREB protein in H9C2 cells after AngII treatment(n=6)

H9C2細胞來源于胚胎期心臟，可以分裂，獲得細胞容易，并且對外界刺激因子作用的反應較成熟期動物心肌細胞敏感，可模擬心肌細胞的功能，進行藥理學、細胞內(nèi)信號傳導通路等的實驗研究。有研究表明［9］，新生大鼠心肌細胞與大鼠心肌H9C2細胞在AngII刺激下，二者形態(tài)學和肥大基因表達上有一定的相似性。因此，本實驗采用H9C2細胞建立心肌細胞肥大模型。AngII是腎素－血管緊張素系統(tǒng)中最為重要的活性成分，是調(diào)節(jié)心肌細胞肥大的重要體液因素［10］。整體和器官水平以及在培養(yǎng)的心肌細胞上的研究相繼證實，AngII具有直接促進心肌細胞肥大的效應。

心肌細胞肥大發(fā)生的生化基礎(chǔ)是心肌蛋白合成增加，進而使心肌細胞體積增大。本實驗在摸索AngII誘導心肌肥大模型時，選取了 10－6、10－7和10－8mol·L－13 種濃度，作用 48 h。AngII(10－6mol·L－1)在作用24 h時，細胞開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，基本不能維持到 48 h，AngII(10－8mol·L－1)作用 48 h，細胞肥大不太明顯，10－7mol·L－1AngII可致細胞肥大較明顯，細胞生長狀態(tài)適中，結(jié)果重復性好，符合制備模型的標準，故選取10－7mol·L－1作為AngII的刺激濃度。結(jié)果顯示，用10－7mol·L－1AngII可以誘導心肌H9C2細胞肥大，表現(xiàn)為細胞表面積增大、細胞蛋白含量增加。F2(10－8、10－7、10－6mol·L－1)能劑量依賴的降低 AngII誘導的心肌H9C2細胞細胞表面積增大和細胞蛋白含量增多。以上結(jié)果表明，F(xiàn)2能抑制AngII誘導的心肌細胞肥大，可能對心肌肥厚有一定的防治作用。

AngII導致心肌細胞肥大是通過細胞內(nèi)復雜的信號傳導通路得以實現(xiàn)的，在各種參與AngII引起心肌細胞肥大的信號物質(zhì)中，ERK1/2是細胞增殖、分化關(guān)系極為密切的、細胞內(nèi)許多信號共同的信息通路和交匯點，這引起了心血管研究領(lǐng)域的極大關(guān)注。以轉(zhuǎn)基因高血壓鼠和正常血壓鼠為研究對象，檢測AngII介導的MAPK家族信號物質(zhì)活性變化與心肌肥厚相關(guān)性，結(jié)果顯示ERK1/2在AngII引起的血壓變化過程中活性明顯增高，ERK1/2與心肌肥厚進展關(guān)系密切，但其確切機制尚不完全清楚［11］。

CREB作為細胞內(nèi)的第三信使，是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子大家族中的一員。CREB蛋白的生物學活性受磷酸化的調(diào)控，CREB分子是多種蛋白激酶的磷酸化底物，如 PKA、MAPK、PKC、CaMKs、CK 等都可以磷酸化CREB蛋白KID區(qū)的Ser133。當CREB蛋白的Ser133被磷酸化后，可以被CBP蛋白特殊的結(jié)構(gòu)域特異性地識別并結(jié)合，可以使啟動子序列上的CRE元件乙酰化，同時啟動基因的轉(zhuǎn)錄。ERK1/2可通過激活CREB核糖體S6激酶(Rsk)來激活轉(zhuǎn)錄因子 CREB，從而作用于 cAMP反應元件(CRE)，啟動 CRE依賴性的轉(zhuǎn)錄。此外，ERK1/2也可直接磷酸化轉(zhuǎn)錄因子CREB［12］。

本實驗為了驗證AngII刺激ERK1/2磷酸化位點在 Thr202/Tyr204上，因此應用了 p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)特異性抗體，用不同濃度的AngII作用 5 min，AngII劑量依賴的增加 p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的蛋白表達，以 10－6、10－7mol·L－1濃度效果較佳。為了驗證AngII刺激CREB磷酸化位點在 Ser133上，本實驗應用 p-CREB(Ser133)特異性抗體，AngII劑量依賴的增加 p-CREB(Ser133)的蛋白表達，以10－6、10－7mol·L－1濃度效果較佳。本實驗發(fā)現(xiàn) AngII刺激細胞時ERK1/2磷酸化水平升高很明顯。同時，ERK1/2下游轉(zhuǎn)錄因子磷酸化的 CREB表達亦有升高，而CREB蛋白無明顯變化，這表明AngII可通過激活MAPK-ERK1/2途徑，刺激CREB的激酶誘導域，使CREB磷酸化而具有轉(zhuǎn)錄活性，進而調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄，引起心肌肥厚。

本研究亦發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2劑量依賴的降低AngII刺激心肌細胞p-ERK1/2蛋白和p-CREB蛋白表達增加，說明F2抑制AngII誘導心肌細胞肥大的機制可能與通過抑制MAPK-ERK1/2-CREB有關(guān)，但是其詳細機制以及因果關(guān)系需進一步的研究得以確證。

綜上所述，F(xiàn)2能抑制AngII刺激心肌細胞的肥大。本研究拓展了F2的作用靶點，存在潛在的治療價值，為其研發(fā)積累了更進一步的藥理學證據(jù)。

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