酶水解降低牛乳蛋白抗原性的研究

付 莉 ， 岳喜慶 ， 宋建新

（1.沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧醫學院 食品學院，遼寧 錦州 121001）

母乳是適合嬰兒生長發育的最完美的食物。但是，有的母親因為個人、文化、經濟和健康等原因選擇人工哺乳。當母乳缺乏時，牛乳因其來源廣泛、與母乳成分較為接近而常被用來作為母乳的替代品。而牛乳與人乳蛋白質含量與成分的差異是牛乳不適癥產生的主要原因。經研究表明引起嬰兒過敏的蛋白質主要為αs-酪蛋白、α-乳白蛋白及β-乳球蛋白。目前牛乳蛋白質致敏性降低的方法主要有超濾［1］、物理處理［2］、生物轉化［3］、酶水解，而由于酶水解后苦味較低，省時，經濟，有功能新肽的產生而被廣泛研究［4-5］。利用酶法降低牛乳蛋白質致敏性，酶的類型和水解條件對產物的相對分子質量、抗原性、苦味程度都有很大的影響，Enaet al.研究表明，肽相對分子質量低于 3 400就不會引起過敏反應［6］，Beresteijn et al.研究表明，肽相對分子質量在3 000～5 000 可誘導免疫反應［7］。

目前市場上已經有一些低致敏性乳配方，主要以輕度水解、深度水解酪蛋白或乳清蛋白及氨基酸為原料的配方。通過確定IgE誘導的牛乳低變應原性，臨床結果顯示幾乎所有的牛乳替代物都有過敏性［8-10］。大量研究顯示，酶解法降低牛乳蛋白質致敏性的研究多集中于單酶水解，因此作者采用混合酶法降低牛乳蛋白抗原性并與單酶法進行比較，試圖進一步降低牛乳的致敏性，為低致敏性嬰兒配方乳的研制打下前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛乳:錦州市乳品廠提供；濃縮乳清蛋白（WPC-80）:北京銀河乳業提供；胰蛋白酶（18 380.23U/g）、風味蛋白酶（15 285.71 U/g）、胃蛋白酶（6 230 U/g）、堿性蛋白酶（18 761.90 U/g）、中性蛋白酶（13 847.19 U/g）、木瓜蛋白酶（15 285.71 U/g）:購于天津諾奧科技酶制劑公司；低相對分子質量標準蛋白（97 400～14 400）:購于上海生物化學研究所；茚三酮、果糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、濃硫酸、碳酸鈉、鄰苯二胺二鹽酸、鄰苯二胺、明膠、吐溫、無水乙醇、H2O2，三氟乙酸均為分析純；乙腈為色譜純；αs-酪蛋白，β-乳球蛋白，羊抗兔 IgG-HRP，α-乳白蛋白，牛血清白蛋白（66 000），胰蛋白酶抑制劑（31 000），溶菌酶（14 400），抑肽酶（6 500），胰島素 b（3 500），人血管緊張肽 II（1 040）:購于 sigma 公司。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴振蕩器、紫外可見分光光度計:上海光譜儀器有限公司產品；DYY-6C電泳儀:北京六一儀器廠產品；DYCZ-24B電泳槽:北京六一儀器廠產品；Aglient 1100高效液相色譜儀:Aglient公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 牛乳水解工藝 新鮮牛乳經4 500 r/min離心20 min脫脂，63℃，30 min殺菌后，4℃儲藏備用[11]。使用前預熱10 min，分別加入胰蛋白酶和風味蛋白酶單獨或兩步水解，水解過程中不斷加入質量分數0.5%的氫氧化鈉維持體系pH 8.0，55℃震蕩60 min，每隔10 min取水解液置于90℃水浴中滅酶10 min后，冷卻，利用茚三酮比色法［12］測定牛乳蛋白水解度。滅酶后的水解液，5 000 r/min離心10 min，取上清，凍干，-20℃保存，用于高效液相色譜分析。

1.3.2 水解液的SDS-PAGE分析 用5 g/dL濃縮膠和15 g/dL分離膠，樣品在濃縮膠中80 V電壓下運行1 h，在分離膠中120 V電壓下運行3 h。用質量分數0.05%考馬斯亮藍R250染色45 min，然后放入脫色液（V（醋酸）∶V（甲醇）∶V（水）=3∶2∶40）中脫色，以相對低分子質量marker標準為參比，得到所需蛋白條帶分子。上樣量均為15 μL。

1.3.3 水解液的高效液相色譜分析 采用Aglient 1100液相色譜儀，色譜柱:TSKG2000SWXL，流動相:V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=45∶55∶0.1，流量:0.2 mL/min，進樣量:5 μl，檢測波長:220 nm，樣品質量濃度為3 mg/mL。柱子先用以下各標準品平衡，牛血清白蛋白（66 000）、胰蛋白酶抑制劑（31 000）、溶菌酶（14 400）、抑肽酶（6 500）、胰島素 b（3 500）、人血管緊張肽 II（1 040）。

1.3.4 多克隆抗體的制備及樣品抗原性測定 多克隆抗體的制備:選取8周齡健康日本大白兔6只，分3組，喂養不含乳蛋白的飼料。每組分別皮下多點注射αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和等體積混合的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，每只兔子免疫劑量為2 mg/mL，每隔兩周免疫1次，免疫4次。每次免疫前，耳緣靜脈取血后，采用雙向免疫擴散法測定抗血清的效價。效價合格后，動脈取血，37℃放置1 h凝血后，4℃冰箱放置過夜，4 000 轉/分離心 3 min 分離血清，-20 ℃凍存備用［13］。抗原測定:間接競爭 Elisa 法［14］。

2 結果與討論

2.1 反應時間與水解度之間關系

圖1顯示了不同酶水解牛乳過程中水解度隨時間的變化情況，胰蛋白酶、風味蛋白酶一步及兩步水解過程中，前40 min，水解度增長較快，而40 min后水解度增長較緩慢。其中胰蛋白酶和風味蛋白酶兩步水解效果好于單獨水解效果。風味蛋白酶屬于內外切混合酶，胰蛋白酶屬于內切酶，先加入胰蛋白酶使蛋白質產生大量短肽，然后再加風味蛋白酶水解短肽，這種水解方式效果更好［15-16］。60 min水解后，胰蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶和風味蛋白酶兩步水解液的水解度分別達到24.6%、20%、26%。胰蛋白酶和風味蛋白酶兩步水解水解度最大，但與胰蛋白酶一步水解相比，差異不顯著，與風味蛋白酶一步水解相比，差異顯著。Svenning指出蛋白質水解程度不應該過大，否則會使終產品太苦而口感不好，且產生大量自由氨基酸不如小肽更容易被人體吸收［17］。

圖1 各種酶水解度與時間關系圖Fig.1 Relationship between DH and time

2.2 不同反應時間內αs-酪蛋白抗原性的變化

圖2顯示了隨著水解時間的增加，風味蛋白酶水解液中αs-酪蛋白抗原性降低率逐漸增加，胰蛋白酶水解液中αs-酪蛋白的抗原降低率先增加后減少而后又增加。胰蛋白酶和風味蛋白酶兩步水解液的αs-酪蛋白抗原降低率也是先增加后減少而后又增加。主要原因是αs-酪蛋白有過敏表位，隨著胰蛋白酶水解的進行，有的過敏表位被水解掉，但同時又有些隱藏在內部的過敏表位又暴露出來，反而增強了其抗原性。水解前40 min各組蛋白酶水解液αs-酪蛋白抗原降低較快，40 min后αs-酪蛋白抗原降低較慢。水解60 min后，風味蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶和胰蛋白酶兩步水解液的抗原降低率分別達到83%、93%、96%。胰蛋白酶和風味蛋白酶兩步水解后αs-酪蛋白抗原性降低率最大，與胰蛋白酶和風味蛋白酶一步水解相比，差異顯著。

圖2 酶水解時間與酪蛋白抗原降低率關系圖Fig.2 Relationship between time and antigen lower rate

2.3 不同反應時間內α-乳白蛋白抗原性的變化

圖3顯示了隨著水解時間的增加，3組蛋白酶水解液的α-乳白蛋白抗原降低率均逐漸增加，水解前40 min抗原降低較快，而40 min后抗原降低率趨于平緩。水解60 min后，3組蛋白酶的α-乳白蛋白抗原性降低率分別達到91%、93%、96%。胰蛋白酶和風味蛋白酶兩步水解后α-乳白蛋白抗原性降低率最大，與胰蛋白酶和風味蛋白酶一步水解相比，差異顯著。α-乳白蛋白的抗原性較β-乳球蛋白易于去除，與Ena研究結果一致[18]。

圖3 酶水解時間與α-乳白蛋白抗原降低率關系圖Fig.3 Relationship between time and antigen lower rate of α-lactalbumin

2.4 不同反應時間內β-乳球蛋白抗原性的變化

圖4顯示了隨著水解時間的增加，胰蛋白酶和風味蛋白酶水解液β-乳球蛋白的抗原降低率逐漸減少，水解前40 min抗原降低較快，而40 min后抗原降低趨于平緩。而胰蛋白酶水解40 min后加入風味蛋白酶，β-乳球蛋白的抗原降低率升高較快。水解60 min后，3組蛋白酶的β-乳球蛋白抗原性降低率分別達到13%、55%、71%。胰蛋白酶和風味蛋白酶兩步水解后β-乳球蛋白抗原性降低率最大，與胰蛋白酶和風味蛋白酶一步水解相比，差異顯著。和3組蛋白酶水解液其他蛋白抗原降低率相比，β-乳球蛋白對蛋白酶的抵抗能力較強，抗原性下降相對較低。

圖4 酶水解時間與β-乳球蛋白抗原降低率關系圖Fig.4 Relationship between time and antigen lower rate of β-lactoglobulin

2.5 水解液的SDS-PAGE分析

水解60 min后，3組蛋白酶水解液及原乳的SDS-PAGE圖如圖5所示，胰、風味蛋白酶兩步水解液中αs-酪蛋白幾乎完全被水解掉，而風味蛋白酶和胰蛋白酶水解液中有少量αs-酪蛋白殘余，3組蛋白酶水解液中β-乳球蛋白含量均有下降，但仍有一定量殘存。3組蛋白酶水解液中α-乳白蛋白含量下降較明顯，殘留量均較少。經胰、風味蛋白酶兩步水解后，產生大量相對分子質量小于14.4的肽類，胰和風味蛋白酶水解液中也有一定量低相對分子質量的肽產生。

圖5 牛乳與牛乳水解液的SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE of full fat milk and its hydrolyzate

2.6 水解液的高效液相色譜分析

表1顯示了胰蛋白酶水解液中有少量相對分子質量大于12 300的蛋白質，主要是牛乳中未水解的乳清蛋白和酪蛋白，水解液中含有大量相對分子質量在1 040～6 500的肽類，少量相對分子質量小于1 040的肽類。表2顯示了風味蛋白酶水解液中有一定量查對分子質量大于12 300的蛋白質，主要是牛乳中未水解的乳清蛋白和酪蛋白，因為胰蛋白酶較風味蛋白酶水解能力強，可以將乳蛋白水解為更多的肽類。表3顯示了胰蛋白酶和風味蛋白酶兩步水解液中相對分子質量小于6 500的肽類占總產物很大的比例，相對分子質量大于12 300的蛋白質幾乎被完全水解，且和雙酶一步水解相比，有更多相對分子質量小于365的小肽產生。

表1 胰蛋白酶水解液蛋白質相對分子質量分布情況Table1 Protein composition distribution oftrypsin hydrolysis

表2 風味蛋白酶水解液蛋白質相對分子質量分布情況Table 2 Protein composition distribution of flavourzyme hydrolysis

表3 雙酶兩步水解液蛋白質相對分子質量分布情況Table 3 Protein composition distribution ofdouble enzyme two-step hydrolysis

3 結語

通過研究發現胰蛋白酶、風味蛋白酶一步水解及胰蛋白酶和風味蛋白酶兩步水解牛乳，均可使α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、αs-酪蛋白的抗原性降低，且胰蛋白酶和風味蛋白酶兩步水解使各蛋白質的抗原降低率更為明顯，尤其對于β-乳球蛋白的抗原降低效果更好。雙酶兩步水解后有大量的相對分子質量低于6 500的肽產生，雖然多數構象抗原表位被水解掉，仍然有線性表位存在，仍然有過敏性。[19]因此后續研究過程中，利用超濾將含有順序表位的長肽與短肽分開是一個很好的解決方案。

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