微囊藻毒素分析檢測(cè)技術(shù)研究

藍(lán)藻水華爆發(fā)是水體富營(yíng)養(yǎng)化特征之一，微囊藻毒素（microcystin，MC）是水華藍(lán)藻產(chǎn)生的主要毒素，對(duì)水生生物、人類飲水安全、食品安全和人類健康都構(gòu)成嚴(yán)重影響。2007年藍(lán)藻水華爆發(fā)引發(fā)了無(wú)錫市公共飲用水危機(jī)，這使得無(wú)錫、蘇州與湖州等太湖周邊城市居民有長(zhǎng)期暴露于藍(lán)藻毒素污染引起健康危害的風(fēng)險(xiǎn)。基于以上原因，湯堅(jiān)、孫秀蘭、肖付剛等眾多科研工作者以太湖為研究載體，圍繞微囊藻毒素的分析檢測(cè)技術(shù)開(kāi)展了深入的研究，取得了豐富的研究成果。

CN200710023770.8公開(kāi)了一種應(yīng)用可特異性識(shí)別藻毒素的抗體來(lái)制備一種藻毒素免疫親和層析填料和免疫親和層析柱及其使用方法。其目的是為了方便從水、水產(chǎn)品、藻類及其制品的提取液中“一步法”富集純化藻毒素，純化后的樣品進(jìn)HPLC或LC-MS等進(jìn)行定性定量分析。該發(fā)明中所制備的藻毒素免疫親和層析柱對(duì)一種藻毒素特異性強(qiáng)，純化效果顯著，明顯優(yōu)于現(xiàn)有的固相萃取方法。該藻毒素免疫親和層析柱提高了富集和純化的效率，從而提高了檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確性，制備方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)使用。CN200810242516.1公開(kāi)了一種微囊藻毒素-LR(MC-LR)多抗免疫親和柱(IAC)的制備和使用方法，其研制的IAC是將MC-LR多抗固定于柱中，從而吸附樣品溶液中的MC-LR，洗脫后起到富集和凈化的效果，然后進(jìn)HPLC進(jìn)行定性定量分析。作為前處理過(guò)程，IAC富集優(yōu)于現(xiàn)有的固相萃取(SPE)法。在HPLC圖中顯示MC-LR多抗IAC能將MC-LR的峰與其它雜質(zhì)峰分開(kāi)，不至影響測(cè)定結(jié)果，而SPE凈化由于雜質(zhì)太多，MC-LR峰甚至難以分辨。由于MC-LR多抗與MC-LR能夠特異性結(jié)合使IAC有很好的特異性，一次凈化能除去絕大部分干擾物。肖付剛，趙曉聯(lián)，湯堅(jiān)等（2009）應(yīng)用自制的微囊藻毒素免疫親和層析柱為凈化工具，建立了固相萃取柱富集、免疫親和層析柱凈化、液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)藍(lán)藻樣品中MC的方法。結(jié)果顯示:只用固相萃取柱富集,會(huì)殘留大量雜質(zhì),干擾MC(尤其是MC-LR)的測(cè)定結(jié)果。而用免疫親和層析柱凈化能有效去除藻樣中的雜質(zhì)，排除干擾，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用法定量,能準(zhǔn)確測(cè)定藻樣中的微囊藻毒素-RR(MC-RR)和-微囊藻毒素-LR(MC-LR).方法的檢出限為2.5 μg/L;線性范圍為5～500 μg/L;MC-RR和MC-LR平均回收率高于84%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%。孫秀蘭在CN200810242879.5中公開(kāi)了一種微囊藻毒素-LR定量快速檢測(cè)生物傳感器的制備及應(yīng)用。該檢測(cè)傳感器為阻抗型電化學(xué)傳感器，由CHI760C型電化學(xué)工作站，三電極體系：免疫電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極組成；將L-半胱氨酸，膠體金，微囊藻毒素抗體復(fù)合物分別包被于裸金電極表面作為工作電極；當(dāng)微囊藻毒素抗體與樣液中的抗原(MC-LR)結(jié)合時(shí)將引起參比電極與工作電極之間電勢(shì)差的變化，與樣品中抗原濃度呈定量關(guān)系，以此進(jìn)行微囊藻毒素的檢測(cè)；成功建立了快速、特異、靈敏的檢測(cè)微囊藻毒素抗原的生物傳感器；檢測(cè)線性范圍：0.05～300 ng/mL，檢出限1.82×10-2ng/mL。既可以對(duì)天然湖泊水進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，又可以對(duì)水廠飲用水的制備過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。閆建秀,虞銳鵬,湯堅(jiān)等（2008）建立一種高效液相色譜法測(cè)定太湖螄螺中微囊藻毒素RR和LR的方法。該方法采用固相萃取法進(jìn)行純化富集,用2極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，比較不同提取溶劑、提取時(shí)間和淋洗液等因素對(duì)樣品中微囊藻毒素提取效率的影響。 色譜條件:色譜柱 300SB Zorbax C18柱(250 mm×4.6 mm I.d.,5 μm),流動(dòng)相為乙腈∶水(V∶V)=35∶65，檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm。在2.5～100 ng的范國(guó)內(nèi),進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。該方法靈敏度高，簡(jiǎn)便快捷，可作為水生物中藻毒素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)水生物體內(nèi)蓄積的藻毒素較可靠的分析方法。鈕偉民，何恩奇等（2011）建立了微囊藻毒素-LR(MC-LR)的納米均相時(shí)間分辨熒光免疫分析法。該方法所得回歸方程為y=-1 812x2-6 075x+12 424(R2=0.9976),檢出限為0.02 ng/mL，批內(nèi)RSD為5.8%～7.2%，批間RSD為9.5%～9.9%，平均回收率為85.0%～120.0%。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、測(cè)定范圍寬、試劑壽命長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，尤其適合于生活飲用水中微量MC-LR的分析。

多種適用于不同種類樣品的微囊藻毒素檢測(cè)技術(shù)的建立及其應(yīng)用，為水體中微囊藻毒素污染的早期預(yù)警提供了理論依據(jù)，從而降低居民通過(guò)飲水途徑對(duì)于微囊藻毒素的暴露。

（江南大學(xué)圖書(shū)館 張群 供稿）