膠質(zhì)芽孢桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)孢培養(yǎng)基的優(yōu)化

王金玲 ， 趙鳳艷， 呂長(zhǎng)山， 張洪超，3

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginous）又名膠凍樣芽孢桿菌，國(guó)內(nèi)通常稱之為硅酸鹽細(xì)菌[1]，是一種多功能菌。

農(nóng)業(yè)上，膠質(zhì)芽孢桿菌具有解鉀、溶磷作用以及易形成根系優(yōu)勢(shì)種特性[2-3]，是目前我國(guó)微生物肥料產(chǎn)品中較為重要的一種。工業(yè)方面，膠質(zhì)芽孢桿菌在無(wú)氮培養(yǎng)基或較大的C/N培養(yǎng)基中易產(chǎn)生顯著的胞外多糖莢膜，利用這種多糖的絮凝作用生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)明顯的微生物絮凝劑前景廣闊[4-5]。冶金工業(yè)上，膠質(zhì)芽孢桿菌可應(yīng)用于細(xì)菌淋濾和改進(jìn)某些礦物材料的特性[6]，尤其對(duì)低品位礦物的開(kāi)發(fā)以及回收利用某些有用金屬具有良好的前景。養(yǎng)殖業(yè)方面，膠質(zhì)芽孢桿菌生長(zhǎng)過(guò)程產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、有機(jī)酸等，可用作飼料補(bǔ)充物，提高飼料的價(jià)值[7]。因此提高膠質(zhì)芽孢桿菌的活菌或芽孢數(shù)量與質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意義。

作者在培養(yǎng)基單因素篩選基礎(chǔ)上，選用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，考察了培養(yǎng)基組成對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，以期更大程度上提高芽孢產(chǎn)量，為膠質(zhì)芽孢桿菌的廣泛應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株 膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginous）CGMCC 1.0910，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種中心，經(jīng)紫外誘變處理，作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:亞歷氏硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基，蔗糖 5 g；磷酸氫二鈉 2 g；七水硫酸鎂 0.5 g；氯化鐵 0.005 g；碳酸鈣 0.1 g；土壤礦物，取耕層土加入體積分?jǐn)?shù)20%鹽酸（耕層土與鹽酸的質(zhì)量體積比為1 g∶10 mL）煮沸30 min，蒸餾水洗至無(wú)氯離子，過(guò) 100 目篩[8]，1.0 g；瓊脂，30 g；蒸餾水 1 000 mL；pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基:蔗糖 10 g；磷酸氫二鉀 0.5 g；七水硫酸鎂 0.5 g；碳酸鈣 1 g；蒸餾水 1 000 mL；pH 7.5。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖20 g；復(fù)合氮源2.5 g；磷酸氫二鉀1 g；七水硫酸鎂1 g；碳酸鈣5 g；蒸餾水1 000 mL；pH 7.0～7.5。 其中，復(fù)合氮源質(zhì)量比為硫酸銨:酵母浸膏粉=3∶1。

1.1.3 試劑 葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、硫酸銨、硫酸錳、磷酸氫二鈉、碳酸鈣、氫氧化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鐵為分析純?cè)噭?，天津天力化學(xué)試劑有限公司；麥芽糖、牛肉膏（氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)13%）、蛋白胨（氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.5%）、胰蛋白胨（氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%）、酵母膏（氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%）、干酪素（氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.5%）、酵母浸膏粉（氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.2%）、玉米漿粉（氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.2%）、瓊脂:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；ZD-85恒溫振蕩器:常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱:哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；DH-6000A電熱恒溫培養(yǎng)箱:天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；XW-80A旋渦混合器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；XB-K-25血細(xì)胞計(jì)數(shù)板:上海求精生化試劑儀器有限公司產(chǎn)品；XSZ-4G雙目顯微鏡:北京聯(lián)合科儀科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法 菌種活化:將保存的菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，32℃活化24 h。

種子搖瓶培養(yǎng):用接種環(huán)挑取3環(huán)菌泥，接入裝有種子培養(yǎng)基35 mL的250 mL三角瓶中，32℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)2 0h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為50 mL/250 mL，36℃，250 r/min振蕩培養(yǎng) 40 h。

1.3.2 分析方法 芽孢計(jì)數(shù)法:試驗(yàn)過(guò)程中因素與組合的優(yōu)劣比較采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法[9]，計(jì)數(shù)前將菌液在80℃水浴槽中熱處理15 min。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）單因素試驗(yàn) 單因素選擇如下:碳源（20 g/dL的葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇），碳源濃度（5、10、15、20、25、30、35 g/dL），有機(jī)氮源（酵母膏、酵母浸膏粉、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、干酪素和玉米漿粉，采用有機(jī)氮源與硫酸銨復(fù)合氮源），復(fù)合氮源質(zhì)量濃度（復(fù)合氮源水平0.625、1.25、1.875、2.5、3.125、3.75、4.375 g/dL，有機(jī)氮源與硫酸銨質(zhì)量比為 1∶3）， 無(wú)機(jī)鹽 （0.1 g/dL，K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、CuCl2、FeSO4·7H2O、MnSO4） 及無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度[10-11]。

培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件:除單因素為變量外，其余采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件，每個(gè)試驗(yàn)3次重復(fù)。

2）二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果組合培養(yǎng)基組分，進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)。

3）驗(yàn)證試驗(yàn) 以優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵工藝參數(shù)按搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件。驗(yàn)證試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理方法 試驗(yàn)中圖表繪制采用M icrosoft Excel處理；二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)與結(jié)果分析采用Design Expert 7.0及SAS 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1 碳源的篩選 碳源的篩選試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，N為芽孢數(shù)量。由圖可知，6種碳源對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響先后順序?yàn)槿樘牵靖事洞迹究扇苄缘矸郏钧溠刻牵菊崽牵酒咸烟?，乳糖明顯優(yōu)于其他碳源，甘露醇次之。這是因?yàn)椴煌荚磳?duì)微生物發(fā)酵的影響與碳源結(jié)構(gòu)和發(fā)酵過(guò)程中的中間代謝產(chǎn)物 （如酶等）有關(guān)，能夠?yàn)榫w快速吸收利用且存在有利于芽孢轉(zhuǎn)換的碳源有利于活菌數(shù)與芽孢產(chǎn)量的提高。

2.1.2 碳源質(zhì)量濃度的篩選 通過(guò)單因素7水平試驗(yàn)對(duì)乳糖濃度進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖2所示。由圖可以看出，當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度為5～20 g/dL時(shí)，芽孢產(chǎn)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；之后隨著添加量的繼續(xù)增大，芽孢量略有下降。曲線初始變化趨勢(shì)明顯，這與碳源對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌的作用方式有關(guān)，增加碳源利于菌體的快速繁殖；但超過(guò)一定濃度后則對(duì)發(fā)酵液的理化性質(zhì)產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致芽孢量有所下降。試驗(yàn)中選擇10～30 g/dL作為進(jìn)一步優(yōu)化的試驗(yàn)范圍。

圖1 不同碳源對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on spore yield

圖2 碳源質(zhì)量濃度對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of carbon source concentration on spore yield

2.1.3 氮源的篩選 試驗(yàn)中采用有機(jī)氮與硫酸銨混合的復(fù)合氮源[10-11]，有機(jī)氮源的篩選中以蛋白胨添加0.625 g/dL和硫酸銨添加1.875 g/dL為參照；其他有機(jī)氮源含氮量調(diào)整到與蛋白胨相同，添加的硫酸銨含量不變。結(jié)果表明（圖3），膠質(zhì)芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量最大的為酵母浸膏粉，其次為蛋白胨；兩者生成芽孢量分別為3.22×109cfu/mL和3.05×109cfu/mL，干酪素對(duì)產(chǎn)孢的影響也較好；但在相同含氮量的情況下，酵母浸膏粉的添加量為蛋白胨的2倍，而增加的芽孢產(chǎn)量為5.6%。

以硫酸銨作為固定無(wú)機(jī)氮源有利于菌體的快速吸收，而采用有機(jī)氮源則可以提供緩釋氮元素，其中還含有一些利于菌體生長(zhǎng)與芽孢轉(zhuǎn)換的生長(zhǎng)因子和微量元素。因此從芽孢產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)方面考慮，試驗(yàn)中選擇微生物發(fā)酵中常用的蛋白胨為最佳有機(jī)氮源。

圖3 不同氮源對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on spore yield

2.1.4 氮源質(zhì)量濃度的篩選 以硫酸銨為無(wú)機(jī)氮源，蛋白胨為有機(jī)氮源，有機(jī)氮質(zhì)量∶無(wú)機(jī)氮質(zhì)量=1∶3進(jìn)行復(fù)合氮源濃度的篩選試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖可知，芽孢產(chǎn)量隨復(fù)合氮源質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先急速上升后緩慢下降的趨勢(shì)，其中曲線峰值出現(xiàn)點(diǎn)為2.5 g/dL。

無(wú)機(jī)氮與有機(jī)氮的搭配有利于滿足發(fā)酵不同階段的需求，既有利于菌體增殖又有利于芽孢的生成，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的需求，選擇的氮源進(jìn)一步優(yōu)化范圍為 1.25～3.75 g/dL。

圖4 復(fù)合氮源質(zhì)量濃度對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of nitrogen source concentration on spore yield

2.1.5 無(wú)機(jī)鹽的篩選 無(wú)機(jī)鹽的篩選試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖可見(jiàn)，在試驗(yàn)濃度條件下，除Mn2＋可以較明顯地促進(jìn)產(chǎn)孢外，其他離子對(duì)促進(jìn)產(chǎn)孢均無(wú)效果，其中 Mg2＋、K+具有輕微抑制作用，而 Zn2＋、Cu2＋、Al3＋、Fe2＋、Fe3＋則表現(xiàn)出明顯的抑制作用， 這可能與金屬離子的作用方式和膠質(zhì)芽孢桿菌的生長(zhǎng)習(xí)性有關(guān)。

2.1.6 硫酸錳質(zhì)量濃度的篩選 金屬離子的篩選試驗(yàn)結(jié)果顯示，硫酸錳具有促進(jìn)芽孢生成的作用，試驗(yàn)中設(shè)計(jì)了單因素7水平篩選試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖可見(jiàn)，在 0.05～0.10 g/dL 和 0.30～0.35 g/dL范圍內(nèi)，芽孢量變化趨勢(shì)均較平緩，曲線中芽孢量較高且曲線變化幅度較大的硫酸錳質(zhì)量濃度范圍是0.10～0.30 g/dL，此范圍可作為下一步優(yōu)化試驗(yàn)的考查范圍。

圖5 不同金屬離子對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different metallic ions on spore yield

圖6 硫酸錳質(zhì)量濃度對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of MnSO4concentration on spore yield

2.1.7 磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度的篩選 金屬離子的篩選試驗(yàn)結(jié)果顯示鉀離子對(duì)產(chǎn)孢有輕微抑制作用，但是多數(shù)研究者的培養(yǎng)基配方中均加入了磷酸氫二鉀[9，12]，為了驗(yàn)證鉀離子對(duì)產(chǎn)芽孢的作用，進(jìn)行磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度的篩選試驗(yàn)，結(jié)果如下圖7所示。

2.1.5 中選擇的質(zhì)量濃度為0.1 g/dL，當(dāng)磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度從0.1 g/dL增加時(shí)，芽孢產(chǎn)量迅速增加（部分?jǐn)?shù)據(jù)未顯示），到1 g/dL時(shí)，lg N達(dá)到9.04，在1～2 g/dL的范圍內(nèi)，變化趨勢(shì)平緩，之后有所下降，說(shuō)明在金屬離子篩選試驗(yàn)中，鉀鹽濃度偏低，造成結(jié)果不同。由于磷酸氫二鉀濃度在1～2 g/dL范圍內(nèi)對(duì)產(chǎn)孢影響不大，所以后續(xù)試驗(yàn)將其固定在最佳水平，即1.5 g/dL。

圖7 磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of K2HPO4concentration on spore yield

2.1.8 硫酸鎂質(zhì)量濃度的篩選 金屬離子的篩選試驗(yàn)結(jié)果顯示鎂離子對(duì)芽孢產(chǎn)量有輕微抑制作用，與鉀離子相似，對(duì)硫酸鎂的濃度篩選試驗(yàn)見(jiàn)圖8所示。由圖可見(jiàn)，隨鎂離子質(zhì)量濃度增加，芽孢產(chǎn)量先增加后下降；硫酸鎂質(zhì)量濃度在1.2 g/dL時(shí)，芽孢產(chǎn)量最大。由于硫酸鎂濃度在0.9～1.5 g/dL范圍內(nèi)對(duì)芽孢產(chǎn)量影響幅度不大，所以后續(xù)試驗(yàn)將其固定在最佳值水平，即1.2 g/dL。

圖8 硫酸鎂濃度對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of MgSO4·7H2O concentration on spore yield

2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基組成

2.2.1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及結(jié)果 碳源與氮源及其質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵具有重要的影響，第一階段的單因素試驗(yàn)已篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為乳糖，有機(jī)氮源為蛋白胨；金屬鹽中硫酸錳對(duì)發(fā)酵產(chǎn)芽孢具有明顯影響，選擇碳源質(zhì)量濃度、氮源質(zhì)量濃度和硫酸錳質(zhì)量濃度進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化，其他因素固定在最佳值水平；因子及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因素及水平表Table1 Factorsand levelsofquadratic regression orthogonal rotation composite design

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Resultsofquadratic regression orthogonal rotation composite design

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 ANOVA for the results

為檢驗(yàn)回歸方程的有效性，按F1=失擬均方/誤差均方，F(xiàn)2=回歸均方/剩余均方的程序進(jìn)行檢驗(yàn)。由表3可知，失擬項(xiàng)的F值為1.62，P=0.26＞0.05，說(shuō)明失擬檢驗(yàn)不顯著，所采用的回歸模型適應(yīng)于本研究中培養(yǎng)基組成的分析；二次回歸模型的F值為71.08，P＜0.000 1， 說(shuō)明模型的擬合極顯著；R2=回歸平方和/總平方和=0.979 9，說(shuō)明所建立的回歸方程能在97.99%水平上很好地表達(dá)碳源質(zhì)量濃度、氮源質(zhì)量濃度及硫酸錳質(zhì)量濃度3個(gè)因素之間的關(guān)系。

2.2.2 主效應(yīng)分析 回歸方程中因素前面系數(shù)的絕對(duì)值大小決定了各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，經(jīng)比較有:X3＞X1＞X2，即考察的 3 種因素對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量的影響大小為硫酸錳質(zhì)量濃度＞碳源質(zhì)量濃度＞復(fù)合氮源質(zhì)量濃度。

2.2.3 最優(yōu)培養(yǎng)基與產(chǎn)量預(yù)測(cè) 針對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸方程，利用SAS9.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)方案的預(yù)測(cè)分析，得到表4的培養(yǎng)基及芽孢量預(yù)測(cè)值。

表4 優(yōu)化培養(yǎng)基預(yù)測(cè)值方案Table 4 Optimization solution in the experiment

根據(jù)優(yōu)化模型可知，在1 L培養(yǎng)基中，當(dāng)乳糖21.57 g，復(fù)合氮源 2.60 g，硫酸錳 0.21 g，磷酸氫二鉀1.5 g，硫酸鎂1.2 g時(shí)，膠質(zhì)芽孢桿菌在搖瓶培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，芽孢產(chǎn)量預(yù)測(cè)達(dá)到3.52×109cfu/mL。

用優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所得膠質(zhì)芽孢桿菌芽孢產(chǎn)量為3.44×109cfu/mL（n=3），實(shí)際值/模型最佳值=0.977，說(shuō)明最佳模型可靠，得到的培養(yǎng)基可被之后發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化試驗(yàn)選用。

3 結(jié)語(yǔ)

1）膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵的研究，目前主要集中在如何提高產(chǎn)菌量或者芽孢數(shù)量方面，以利于后期的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。在膠質(zhì)芽孢桿菌的培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件均對(duì)最終有效活菌數(shù)產(chǎn)生較大的影響。

胡秀芳等[13]對(duì)一株離子束誘變的膠質(zhì)芽孢桿菌進(jìn)行了培養(yǎng)條件研究，結(jié)果表明，碳源對(duì)生物量和芽孢形成的影響最大，其次是氮源，磷和鉀的影響較??；發(fā)酵培養(yǎng)基的理想配方（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為:2%淀粉 、0.4% 酵 母 、0.1%K2HPO4、0.1%MgSO4·7H2O、0.5%CaCO3，pH 7.5；種子菌經(jīng)二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后，芽孢量可達(dá)到9.8×108cfu/mL。劉五星[10]等人通過(guò)正交試驗(yàn)獲得膠質(zhì)芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基組成為 （%）:葡萄糖 1， 硫酸銨 0.15， 酵母膏 0.01，KCl 0.01，MgSO4·7H2O 0.01，NaH2PO40.01，CaCO30.1，此條件下活菌數(shù)可達(dá)6.5億/mL。李東華等[14]的研究結(jié)果為糖蜜 3.2%，復(fù)合氮源（m（硫酸銨）∶m（豆粕）=2∶1）0.4%，pH 8.0，為最佳培養(yǎng)基條件，響應(yīng)面法預(yù)測(cè)的最大理論數(shù)值為3.03×108cfu/mL，實(shí)際值為3.09×108cfu/mL。

試驗(yàn)中獲得的膠質(zhì)芽孢桿菌最佳培養(yǎng)基組成為1 L培養(yǎng)基中，乳糖21.57 g，復(fù)合氮源2.6 g，硫酸錳 0.21 g，磷酸氫二鉀 1.5 g，硫酸鎂1.2 g，pH 7.0～7.5。以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，芽孢產(chǎn)量達(dá)到3.44×109cfu/mL。本研究結(jié)果不同于其他研究者的結(jié)果，可能是菌株?duì)I養(yǎng)型不同，或者菌株生長(zhǎng)的環(huán)境不同等原因造成的。

試驗(yàn)中對(duì)常見(jiàn)的碳源、有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明不同結(jié)構(gòu)及不同聚合度的碳源對(duì)微生物的菌體密度及芽孢轉(zhuǎn)化具有一定的影響。采用不同有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中芽孢形成量也有差別，干酪素作為氮源形成的芽孢量也較多，可能與其中氮素的存在形式和營(yíng)養(yǎng)因子[15]有關(guān)，具體作用機(jī)制還有待研究。此外，復(fù)合氮源的配比上試驗(yàn)選擇為固定的有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源質(zhì)量比為1∶3，這種組合對(duì)不同的有機(jī)氮而言也會(huì)有一些影響。無(wú)機(jī)鹽中硫酸錳對(duì)于芽孢的形成具有明顯促進(jìn)作用，這在其他研究者的結(jié)果中未體現(xiàn)，錳離子對(duì)于芽孢的促進(jìn)作用機(jī)理，還需要進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基組成，得到了有效的回歸方程和預(yù)測(cè)方案，這表明此設(shè)計(jì)方案對(duì)預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果具有一定的可行性。二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)為面體反應(yīng)，因此它與一些復(fù)雜的響應(yīng)面[16]等方法的效果具有一定的可比性，而試驗(yàn)過(guò)程則得到了簡(jiǎn)化。

2）膠質(zhì)芽孢桿菌最佳培養(yǎng)基組成為1 000 mL培養(yǎng)基中，乳糖21.57 g，復(fù)合氮源2.6 g，硫酸錳0.21 g，磷酸氫二鉀 1.5 g，七水硫酸鎂 1.2 g，pH 7.0～7.5。以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，芽孢產(chǎn)量達(dá)到3.44×109cfu/mL。

通過(guò)分階段的優(yōu)化試驗(yàn)，即單因素試驗(yàn)，二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及驗(yàn)證試驗(yàn)，得到了膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成，并預(yù)測(cè)芽孢量，與驗(yàn)證試驗(yàn)實(shí)際值相符，說(shuō)明模型的可靠性。所得最佳培養(yǎng)基可以為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)膠質(zhì)芽孢桿菌提供參考數(shù)據(jù)。

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