新型復合酶在肉雞飼料中的應用

楊道秀， 李夏蘭， 陳培欽， 王林林

（華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021）

在家禽飼養上，隨著玉米供給量的缺口越來越大，人們逐漸利用小麥、大麥和燕麥等飼料原料代替玉米來飼養家禽，但是當這類原料在家禽日糧中含量過多時，往往會造成飼料利用率差、家禽生長不良以及環境污染等問題，這主要與高木質纖維飼料原料中存在非淀粉多糖抗營養因子有關，這些抗營養因子會增加消化道食糜粘性，影響消化道生理形態，阻礙營養物質消化吸收，降低飼料轉化率，影響腸道菌群，對家禽的健康成長造成不利的影響。消除抗營養因子的方法很多，主要包括物理方法、化學方法及生物方法。非淀粉多糖酶作為一種“綠色”添加劑，被認為是目前消除非淀粉多糖抗營養因子最有效的方法之一。飼料中的非淀粉多糖降解酶，主要包括木聚糖酶、纖維素酶、木糖苷酶等[1-4]。從整個世界范圍來看，飼料酶的添加率不足60%，而在中國尚不足20%，飼料酶的應用還具有很大的上升空間。

研究結果表明，在禾本植物纖維中，反式阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，ferulic acid，簡稱FA）是含量最多的酚酸，在谷物的細胞壁中，反式FA主要是以酯鍵與半纖維素連接。半纖維素中的FA、雙FA含量及連接方式決定了細胞的延長性、可塑性及降解性，因此斷裂FA與半纖維素連接的酯鍵是提高半纖維素降解程度的重要因素[5]。阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73，feruloyl esterase，簡稱 FAE），是重要的細胞壁降解酶，其主要生物功能是水解多糖與FA連接的酯鍵，釋放FA[6-7]。目前國內的發酵飼料中還未有添加FAE的報道。課題組的前期研究結果及已有報道都表明，木聚糖酶及FAE能夠共同降解植物細胞壁，同時釋放 FA和低聚木糖（xylooligosaccharide，簡稱 XOS）[8-10]。 XOS 其無毒安全的特性，已成為最具潛力的動物保健品和抗生素替代品[11]。FA具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗突變、抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗血栓、降低膽固醇和降血脂等生理功能，在日本，反式FA已應用于食品添加劑中[12]。隨著畜牧業的迅速發展，研發高質量的飼料已經成為國內外研究的熱點。另外，隨著經濟社會的發展，抗生素的危害已經越來越為人們所熟知，抗生素的少用或者不用是必然的發展方向。

作者主要報道了實驗室自行發酵的FAE及商品飼料酶-溢多酶（主要含木聚糖酶（25 000 U/g）、纖維素酶（800 U/g）、甘露聚糖酶（2 000 U/g）、β-葡聚糖酶（30 000 U/g）、α-淀粉酶（300 000 U/g））酶解麥糟的工藝，及將酶解后的麥糟添加于飼料中飼喂肉雞的實驗結果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 反式阿魏酸標準品:Sigma公司產品；阿魏酸甲酯:華僑大學曾慶友老師自行合成；低聚木糖標準品、木二糖標準品:日本和光純藥工業株式會社產品；葡萄糖標準品:上海國藥化學試劑有限公司產品；溢多酶AF831:廣州溢多利公司產品；玉米及豆粕:廈門市振裕飼料有限公司產品；預混料:廈門百惠行科技有限公司產品；麥糟:廈門青島啤酒廠產品。

1.1.2 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀:美國安捷倫公司產品；HPX-42A柱:美國Bio-Rad公司產品；ODS-C18色譜柱:美國Thermo公司產品；SP-2102UV紫外可見分光光度計:上海光譜儀器有限公司產品；超濾膜包Vivaflow 200:北京賽多利斯儀器有限公司產品。

1.1.3 菌種 黑曲霉:作者所在實驗室篩選保藏。

1.1.4 雞苗 青腳麻雞:廈門五顯鎮三秀種禽廠提供。

1.2 培養基及其培養條件

1.2.1 種子培養基 PDA培養基，36℃培養2 d。

1.2.2 發酵培養基 將麥糟烘干過65目篩，按m（麥糟）︰m（麥麩）=4︰1的比例，每個搪瓷盤中加入麥糟和麥麩的混合物50 g及75 mL營養鹽溶液，混勻，121℃滅菌30 min。每個搪瓷盤中接種12.5 ml菌液，33℃培養6 d。

營養鹽溶液:蛋白胨 2 g，酵母粉 4 g，NaH2PO4·2H2O 1.52 g，KH2PO41 g，CaCl20.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，Na2HPO4·12H2O 31.4 g，Na2HPO4·2H2O 15.6 g，用蒸餾水定容至1 L。

1.2.3 FAE粗酶液制備

1）發酵培養基抽提 將發酵液加入1 000 mL蒸餾水，置于33℃，180 r/min的搖床中振蕩2.5 h，取出靜置，用8層紗布過濾。

2）發酵液濃縮 在超濾膜相對分子質量為30 000，進口壓力為0.1 MPa，進料速度為200 mL/min，20℃操作條件下，超濾濃縮，濃縮后的FAE酶活達到20 U/mL以上。

1.3 各種物質測定方法

1.3.1 FA測定 按文獻方法分析[13]。

1.3.2 XOS測定 按文獻方法分析[13]。

1.3.3 還原糖測定 采用DNS法[14]。

1.4 復合酶酶解麥糟工藝研究

1.4.1 FAE添加量對麥糟酶解效果的影響 稱取5 g含水量70%的麥糟置于50 mL三角瓶中，固定溢多酶的添加量為質量分數0.012%，分別以0、11、22、33、44、55 U 添加濃縮后的粗酶液，50 ℃， 酶解24 h。酶解后，往每個錐形瓶中加入20 mL的蒸餾水，40℃，浸提 2.5 h后，4 ℃，10 000 r/min，離心 20 min。取上清液測定FA、XOS、還原糖含量。

1.4.2 不同溫度對麥糟酶解效果的影響 添加FAE 8.8 U/g 麥糟， 控制酶解溫度為 20、30、40、50、60℃，其他操作同1.4.1。

1.4.3 不同酶解時間對麥糟酶解效果的影響 酶解溫度為 40 ℃， 控制酶解時間為 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 d，其他操作同 1.4.2。

1.4.4 不同含水量對麥糟酶解效果的影響 酶解時間為 2.5 d， 調節麥糟含水量為 30、40、50、60、70%，其他操作同1.4.3。

1.4.5 不同的酶解方式對麥糟酶解效果的影響麥糟含水量為 50%，按（1）～（5）組添加各酶液，其他操作同1.4.4。

（1）不加任何酶液，放置 60 h；（2）往麥糟中添加溢多酶0.006%，酶解24 h后，添加溢多酶0.006%（g/g 麥糟），再酶解 36 h；（3）往麥糟中添加FAE 4.4 U/g麥糟，酶解24 h后，添加FAE 4.4 U/g麥糟，再酶解 36 h；（4）往麥糟中添加FAE 8.8 U/g麥糟及溢多酶 0.012%（g/g麥糟）， 酶解 60 h；（5）往麥糟中添加0.006%溢多酶，酶解12 h后，添加FAE 4.4 U/g麥糟，酶解12 h后；加入溢多酶0.006%，酶解12 h后，最后加入FAE 4.4 U/g麥糟，酶解24 h。

1.5 復合酶對肉雞生產性能的影響

1.5.1 麥糟的處理及飼料配方

1）麥糟的處理 各組麥糟分別按如下處理:Ⅰ組，每克含水量50%的麥糟加入0.3 mL蒸餾水；Ⅱ組，每克含水量50%的麥糟加入0.3 mL蒸餾水及溢多酶0.012%；Ⅲ組，每克含水量50%的麥糟加入6.6 U FAE粗酶液；Ⅳ組，每克含水量50%的麥糟加入6.6 U FAE粗酶液及0.012%溢多酶；將上述麥糟在40℃下酶解60 h后，按肉雞日糧配方添加入飼料中。

2）飼料配方及營養水平 肉雞日糧標準參照（NY/T33-2004雞飼養標準）中肉雞營養需要，配制成粉狀飼料，粗蛋白含量為19%，代謝能為12.34 MJ/kg。

3）實驗分組 選用15日齡青腳麻雞，稱重，選出實驗雞，將肉雞分為4組，每組5個重復，每個重復8 只雞（公母混合雛），實驗組 1、2、3、4 添加的麥糟分別按上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的方法處理，其他成分相同。

1.5.2 肉雞飼養及管理 試驗場地為廈門市“仙靈旗”生態農牧科技有限公司新搭建養雞場。采用地面平養方式飼養，全天光照，每天飼喂3次，自由采食、飲水，定時對雞舍進行消毒清掃（每周兩次），預飼期3 d，實驗時間為24 d，按正常肉雞免疫程序進行免疫。在第17 d，41 d的早晨9:00空腹稱重，記錄投料量與剩料量，統計肉雞的死亡率，計算每只雞日增重，平均日采食量，料肉比。

1.5.3 數據統計分析 數據采用SPSS 19.0軟件的ANOVA進行方差分析，Duncan法進行多重比較，各組數據以平均數±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 復合酶酶解麥糟工藝

2.1.1 添加不同量FAE對酶解效果的影響 添加不同FAE酶量對麥糟進行酶解，結果如圖1。

圖1 添加酶量對酶解效果的影響Fig.1 Influenceoftheamountofenzymeon the enzymatic hydrolysis effect

由圖1可知，隨著FAE添加量的增大，FA、還原糖和XOS的含量都逐漸增大。添加的FAE酶活為6.60 U/g麥糟時，酶解得到的XOS含量達到最大，為1.76 g/L；添加酶量為8.80 U/g麥糟時，FA含量達到最大，為0.66 mg/L。但是進一步加大酶的添加量，FA及XOS的含量卻減少，一方面可能是酶液中的FA對酶產生抑制作用，從而影響了酶對麥糟的酶解效果；同時在固定溢多酶的添加量時，只有使得FAE添加的量合適，才能使兩者的協同作用達到最大。綜合考慮，選擇FAE的添加量為6.60～8.80 U/g麥糟，酶解效果較好。

2.1.2 不同溫度對酶解效果的影響 在不同溫度下進行酶解，結果如圖2。

圖2 溫度對酶解效果的影響Fig.2 Influence oftemperatureon theenzymatic hydrolysis effect

由圖2可知，隨著溫度的升高，FA、還原糖及XOS的質量濃度均有所增加，當溫度達到40℃時，FA及XOS的含量都達到最大，分別為0.52 mg/L和2.41 g/L，但是隨著溫度的繼續升高，兩者的質量濃度都下降，主要的原因是FAE和木聚糖酶都是不耐熱的酶，當溫度超過40℃時，酶活穩定性迅速降低[15-16]。溫度達到50℃時，還原糖的質量濃度達到最大，為4.33 g/L，溫度繼續升高還原糖含量也下降。由此可知，復合酶最佳的酶解溫度為40℃，此時復合酶的協同效應最佳。

2.1.3 不同酶解時間對酶解效果的影響 對麥糟酶解不同時間，結果如圖3。

圖3 酶解時間對酶解效果的影響Fig.3 Influence of the time on the enzymatic hydrolysis effect

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，各個產物質量濃度均在不斷的增加，2 d時，還原糖達到最大值，為3.72 g/L，而2 d之后隨著時間的延長含量逐漸下降。FA及XOS則在2.5 d時達到最大值，分別為0.63 mg/L和1.20 g/L。反應酶解時間超過60 h，各產物的含量均在降低。這是因為隨著酶解時間的延長，FA和XOS易被氧化而破壞。由于在2.5 d時，FA及XOS達到最高值，且還原糖含量也處于一個較高值，因此選定2.5 d為最佳的酶解時間。

2.1.4 不同水分質量分數對酶解效果的影響 在不同水分質量分數下對麥糟進行酶解，結果如圖4。

圖4 水分質量分數對酶解效果的影響Fig.4 Influence of the water content on the enzymatic hydrolysis effect

由圖4可知，當麥糟水分質量分數為50%時，酶解得到的FA、還原糖和XOS的含量都達到最大，分別為0.64 mg/L，4.20 g/L和1.95 g/L。當麥糟水分質量分數高于或者小于50%時，FA、XOS和還原糖質量濃度都下降。因此選定50%為最佳的水分質量分數，進行酶解。

2.1.5 不同酶解方式對酶解效果的影響 采用1.4.5的方法進行實驗，結果如圖5。

圖5 不同酶解方式對酶解效果的影響Fig.5 Content of each enzymatic hydrolysis product

由圖5可知，同時加入溢多酶和FAE的實驗組XOS及還原糖質量濃度最高，達到了5.1 g/L和3.87 g/L，FA質量濃度也較高，達到0.98 mg/L，所得的FA、XOS和還原糖含量較未添加任何酶的對照組分別提高了1.88倍，50倍，19.37倍；只加入溢多酶的實驗組FA含量最高，達到了2.25 mg/L，但XOS和還原糖質量濃度都很低；只加入FAE的實驗組FA、XOS和還原糖質量濃度分別為0.84 mg/L，3.32 g/L，2.03 g/L，但是比兩種酶都加的效果差；分批加入溢多酶及FAE的各物質含量比起同時添加的質量濃度都低，FA、XOS和還原糖含量為0.91 mg/L，3.63 g/L，2.06 g/L。由此可知兩種酶協同降解麥糟比單獨添加，降解的效果更為顯著，多酶協同降解麥糟具有更大的優越性，兩種酶同時添加的效果又比分批添加的效果要好。

2.2 復合酶對肉雞死亡率的影響 將按5.2.4.1處理后的麥糟，以7%的比例添加入肉雞基礎日糧中，肉雞飼養成活率結果如表1。飼喂全程中，飼料中未添加任何的抗生素及其他的藥，由表1可知各組雞的病死亡率均為0，差異不顯著（P<0.05），病死亡率中并未體現出（溢多酶+FAE）組抗病的優勢。這可能與新建場地衛生條件好，通風，未遇到瘟病有關。

表1 復合酶對肉雞成活率的影響Tab.1 Effect of compound enzyme on survival rate of broiler

2.3 復合酶對肉雞生產性能的影響

按1.5.2進行肉雞飼養，飼養結果如表2。從表2可知，與對照組相比，溢多酶組和（FAE+溢多酶）組均能提高肉雞日增重，分別提高了0.78%，4.37%，但是差異不顯著。而溢多酶組、FAE組和（FAE+溢多酶）組均有降低日采食量的趨勢，分別降低了3.28%，4.83%，3.51%，但是差異不顯著（P﹥0.05）。（FAE+溢多酶）組對降低料肉比具有極顯著的作用（P<0.01），降低了7.63%；而添加FAE組及溢多酶組均能降低料肉比，分別降低了3.25%、4.01%，但是差異不顯著（P﹥0.05）。

表2 復合酶對肉雞生產性能的影響Tab.2 Influence of compound enzyme on the production performance of broiler

Yu等[17]報道了將FAE、木聚糖酶、纖維素酶及β-葡萄糖酶共同作用，燕麥的消化性比不加FAE提高了79%。Bartolome等[5]把來自黑曲霉的FAE或熒光假單胞桿菌的FAE與木聚糖酶共同作用于大麥和小麥的細胞壁，其游離的FA釋放量提高了2-6倍。但單獨使用FAE降解植物細胞壁，降解率也是較低的。Topakas等[18]報道，FAE與木聚糖酶同時作用從植物細胞壁中釋放的FA量是僅木聚糖酶單獨作用時的6.3倍。作者主要是在飼料中同時添加溢多酶和FAE，二者對木質纖維的降解具有協同作用，共同促進植物細胞壁的降解提高飼料的飼用效率，促進營養物質的吸收利用，同時產生FA及XOS也具有生理活性。

3 結語

1）麥糟酶解工藝最佳酶解條件為:時間2.5 d，操作溫度40℃，水分質量分數為50%，添加酶量為6.6～8.8 U/g麥糟。同時添加FAE和溢多酶，對麥糟的酶解效果較好，所得的FA、XOS和還原糖質量濃度較未添加酶的實驗組分別提高了1.88倍，50倍，19.37倍。

2）FAE及溢多酶均能夠促進肉雞的生長，但效果不顯著，而同時添加FAE及溢多酶組能夠顯著促進肉雞的生長，日增重提高4.37%，料肉比降低7.63%。

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