無溶劑體系酶催化酯化反應合成1，3-甘油二酯的研究

魯 珊， 黃健花， 王興國

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

甘二酯，也稱為脂肪酸甘油二酯（DAG），是由丙三醇（甘油）與兩個脂肪酸酯化得到的產物，按空間異構分為 1，3-甘二酯（1，3-DAG）和 1，2-甘二酯（1，2-DAG）。其中，天然食用油脂中的甘二酯以1，3-DAG為主，占甘二酯總量的70%左右。1，3-DAG具有很好的乳化性能，可作為乳化劑廣泛應用于食品、藥品和化妝品等行業；另一方面還具有許多生理功能，可用于預防與治療高脂血癥及與高脂血癥密切相關的心腦血管疾病，近年來受到人們的廣泛關注[1-3]。

目前合成1，3-DAG主要有化學法和酶法。化學法得到高純度的產品比較困難，往往需要多步驟的反應以及繁瑣的純化操作[4]。酶法反應條件溫和，且由于酶的選擇性，較易得到高純度的1，3-DAG。角田昭等人研究了在脫水條件下利用堿性脂肪酶進行的酯化反應，反應48h酯化率達到96%，甘油二酯質量分數為60%[5]。Masakatsu[6]等人利用固定化脂肪酶作為催化劑進行酯化反應，酯化率能達到86%左右，甘油二酯質量分數可達65%，但是反應是使用的是非特異性脂肪酶，所以得到的DAG是1，3-DAG和1，2-DAG的混合物。邱壽寬等人用Lipozyme RM IM做催化劑，以大豆和甘油為底物，在最適條件下，甘二酯得率為51.7%。

作者選用特異性酶Lipozyme RM IM做催化劑，以脂肪酸、甘油為原料直接酯化生成1，3-DAG，不僅反應方便，可一步完成，且產物純度較高，反應時間較短，為進一步放大和商業化提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

Lipozyme RM IM（物理吸附大孔陰離子交換樹脂）:諾維信生物技術有限公司產品；甘油（AR級）:國藥化學試劑有限公司產品；油酸（AR級）:國藥化學試劑有限公司產品。

Re-52型旋轉蒸發器:上海亞榮生化儀器廠產品；集熱式恒溫磁力攪拌水浴鍋:金壇市醫療儀器廠產品；Waters 1525高效液相色譜:美國Waters公司產品；TGL-16B離心機:上海安亭科學實驗儀器廠產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 酯化方法 取16.14 g油酸，然后將油酸與甘油按一定摩爾比混合，于一定溫度、80 r/min攪拌均勻，添加一定量的固定化酶于真空反應器（真空度0.07 MPa）或常壓反應器反應一定時間。反應過程中，按一定時間間隔取樣分析反應物組成。

1.2.2 酸值的測定 按GBT 5530-2005進行。

1.2.3 酯化率的計算

酯化率（%）=[（反應起始酸價-反應物的酸價）/反應起始酸價]×100%

1.2.4 甘油酯組成分析 酯化產物用正己烷萃取，加少量水離心收集油相，吹氮氣除溶劑，HPLC分析。分析條件:Waters Spherisorb Silica色譜柱（2.0 mm×250 mm）；流動相 A:正己烷-異丙醇（體積比99∶1）；流動相 B:正己烷-異丙醇-乙酸（體積比 1∶1:0.01）進行梯度洗脫，柱溫:35 ℃；進樣量:5 μL；漂移管溫度:75℃；流動相流量:0.5 mL/min。檢測器:蒸發光散射檢測器，面積歸一化法定量。

2 結果與討論

2.1 反應產物組成

甘油與油酸反應后的產物組分有TAG、FFA、1，3-DAG、1，2-DAG 和 MAG，如圖 1 所示:

圖1 反應產物的高效液相圖Fig.1 HPLC chromatograms of reaction products

2.2 真空脫水對酯化率的影響

適宜的水分含量是維持酶活力所必須的。但當水分含量超過一定量后，脂肪酶的酯化活力會大大降低，而表現為較高的水解活力。在酶催化酯化反應過程中，會生成水，水的存在不利于平衡向酯化方向進行。因此，采用一定措施去除體系中過量的水使反應平衡向合成方向移動，不僅可以提高酶活，也可以增加酯化率。作者考察了常壓及真空條件下進行的酯化反應的進程曲線。

圖2 脫水對1，3-DAG質量分數和酯化率的影響Fig.2 Effect of water removal on 1，3-DAG yield and conversion rate

由圖 2可知，在常壓下，反應 2h，1，3-DAG含量和酯化率分別是48%和52%；在真空條件下，反應2h，1，3-DAG含量和酯化率分別為62%和78%。之所以有這樣的差距，可能是因為甘油是極性分子，在常溫常壓條件下甘油和脂肪酸供體之間的相容性很差，當甘油和脂肪酸供體混合后與脂肪酶接觸時，極性的甘油分子傾向于包裹在脂肪酶上而造成酶的催化效率降低[8]。由此可見，在酯化生產1，3-DAG反應中除去反應生成的水分是十分必要的。

2.3 底物摩爾比的影響

任何一種底物摩爾數的改變，都會影響體系的穩定性及產物的擴散速率與含量，從理論上脂肪酸與甘油的摩爾比例在化學計量比 （2∶1）會使1，3-DAG質量分數達到最佳。如果脂肪酸質量分數過高，則底物利用率不高；如果甘油質量分數過高，不僅使體系的黏度加大，不利于反應的進行，而且體系極性增加，甘油與脂肪酶易沉積在底部，難以與脂肪酸有效的混合，使反應速率降低[9-10]。

作者以1，3-DAG質量分數及酯化率為指標，研究了反應溫度65℃，Lipozyme RM IM添加量6%（以底物總質量計），真空脫水（0.07MPa）的條件下，油酸、甘油的摩爾比對酯化合成1，3-DAG的影響，結果如圖3所示。

圖3 底物摩爾比對1，3-DAG質量分數和酯化率的影響Fig.3 Effect of the molar ratio on 1，3-DAG yield and conversion rate

由圖3可知，1，3-DAG質量分數隨著底物摩爾比（油酸與甘油的摩爾比）的增加而出現先上升后下降的趨勢。在底物摩爾比為2∶1時，反應2 h，1，3-DAG得率最高，可達到62%，酯化率為78%。當油酸與甘油的摩爾比例大于2∶1而小于3∶1（理論上生成TAG的比例）時，1，3-DAG得率和酯化率都會下降，這可能是因為體系中更多的油酸會趨向于轉化為TAG，所以造成DAG的得率下降，進而1，3-DAG得率會下降。因此，反應體系中底物摩爾比采用2∶1為宜。

2.4 酶量的影響

在油酸與甘油摩爾比為2∶1，反應溫度為65℃， 真空脫水 （0.07 MPa），4%、6%、8%（底物總質量計）作為酶量研究的變量條件下，考察了加酶量對1，3-DAG質量分數和酯轉化率的影響，結果見圖4。

圖4 酶量對1，3-DAG質量分數和酯化率的影響Fig.4 Effect of enzyme load on 1，3-DAG yield and conversion rate

由圖4可知，當酶量從2%增加到6%時，反應到2h時，1，3-DAG質量分數從50%上升到62%；酯化率從52%上升到78%，當繼續增加酶量到10%時，1，3-DAG的質量分數和酯化率都是呈下降趨勢的，這可能是由于酶底物數量有限，達到飽和，并且固體脂肪酶量過大，反應體系流動性差，反應一定程度受阻[11]。同時發現，隨著反應時間的增加，1，3-DAG含量呈下降趨勢，而酯轉化率呈上升趨勢，當反應時間到4 h后，酯化率為94%后，基本保持不變，由此可見酯化率最高時，1，3-DAG含量并非最高，這可能是由于體系反應過程中的酰基轉移產物中1，2-DAG和TAG含量增加存在所致，因此以后的研究中酶添加量采用6%為宜。

2.5 溫度的影響

適宜的溫度控制對酶催化反應是重要的。脂肪酶來源不同，最適溫度也各不相同。一般而言溫度升高，有利于酯化反應副產物水的脫除，加快反應速率，但溫度過高，則會影響酶的空間結構和構象，從而降低酶活力。所以實驗需控制適宜的反應溫度。研究了不同的溫度對反應產物中1，3-DAG含量及酯化率的影響。如圖5所示。其他反應參數為:油酸與甘油底物摩爾比2∶1，Lipozyme RM IM添加量6%（以底物總質量計），真空脫水（0.07 MPa）。

由圖5可知，隨著溫度的升高，1，3-DAG的含量和反應初速度都是增加的，當溫度為65℃時，反應時間為2 h時，1，3-DAG的質量分數最高達到61%，酯化率為78%。當溫度高于60℃時，1，3-DAG的質量分數和反應初速度則降低。這可能是由于反應溫度升高時，物質在反應體系中的溶解度會有很大提高，體系黏度低，傳質速率就快，進而反應速度快。然而，隨著溫度的進一步升高 （溫度高于65℃），熱力學平衡占據主導地位，酰基位移增加（1，2-DAG由4.1%上升至8.9%），使1，3-DAG質量分數下降[12]。另外可以看到，隨著反應時間的增加，1，3-DAG的質量分數呈下降趨勢，當5 h后趨于平衡，而酯化率則緩慢增加，當4 h后保持不變。綜合考慮以上因素，選擇65℃作為反應溫度較佳。

圖5 溫度對1，3-DAG質量分數和酯化率的影響Fig.5 Effect of temperature on 1，3-DAG yield and conversion rate

3 結語

采用RM IM酶催化脂肪酸與甘油合成1，3-DAG，利用真空脫水，油酸與甘油的摩爾比為2∶1，溫度為65℃，酶量為底物總質量的6%時，1，3-DAG得率最高為62%。

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