植物抗凍蛋白分離純化方法的研究進(jìn)展

徐化能， 馬淑鳳， 張連富

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

抗凍蛋白（Antifreeze Protein，AFP）或冰結(jié)構(gòu)蛋白是一類能夠抑制冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶的蛋白質(zhì)，它能以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點(diǎn)而對(duì)其熔點(diǎn)影響甚微，這種引起的熔點(diǎn)與冰點(diǎn)的差值稱為熱滯活性，因而抗凍蛋白亦稱為熱滯蛋白[1]。抗凍蛋白可通過(guò)直接混合、浸泡、真空滲透等物理手段，添加到冰淇淋、冷凍肉制品和冷凍面團(tuán)等食品中，來(lái)減少冰晶形成和重結(jié)晶對(duì)冷凍食品質(zhì)構(gòu)的破壞，改善冷凍食品的品質(zhì)與性能，延長(zhǎng)貨架期[2-11]。

抗凍蛋白在植物、海洋魚類、昆蟲和微生物中均有分布，而植物抗凍蛋白最容易為食品生產(chǎn)企業(yè)和一般消費(fèi)者所接受，其來(lái)源也比較廣泛易得。因此，關(guān)于抗凍蛋白的商業(yè)利用和研究就集中到植物來(lái)源的分離上。研究發(fā)現(xiàn)，植物抗凍蛋白的熱滯活性比魚類和昆蟲抗凍蛋白的熱滯活性低，但植物抗凍蛋白有高的重結(jié)晶抑制功能[1]。目前，多種植物抗凍蛋白已被分離純化和表征，包括冬黑麥（Secale cereale L.）[12]、 胡 蘿 卜 （Daucus carota）[13-14]、冬 小 麥（Triticum aestivum）[15]、 沙 冬 青 （Ammopiptanthus mongolicusere）[16-18]、女真葉（Ligustrum lucidum）[19]、連翹[20]等。對(duì)多種植物抗凍蛋白的分析結(jié)果表明，不同來(lái)源的抗凍蛋白的多肽結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別，有些含有糖配基，有些則不含有糖配基。

鑒于抗凍蛋白在冷凍食品工業(yè)領(lǐng)域具有的廣闊應(yīng)用前景，GB2760-2011已將其列為可用于冷凍食品中的新型食品添加劑。因此，對(duì)植物抗凍蛋白進(jìn)行高效分離純化的方法亟待研究。作者擬對(duì)目前植物抗凍蛋白的分離純化方法進(jìn)行歸納，并對(duì)存在的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析，以期為未來(lái)抗凍蛋白分離技術(shù)的發(fā)展提供一定的參考。

1 傳統(tǒng)層析分離方法

傳統(tǒng)從冷帶植物中分離抗凍蛋白的步驟一般包括植物原料均漿、離心、硫酸銨或乙醇分級(jí)沉淀、超濾、脫鹽、上離子交換柱、梯度洗脫、過(guò)凝膠過(guò)濾層析柱、濃縮、冷凍干燥等步驟。例如，Kontogiorgos等[15]將冷誘導(dǎo)的冬小麥草非原質(zhì)體提取物經(jīng)過(guò)熱處理、超濾膜濃縮、乙醇分級(jí)沉淀和體積排阻色譜等步驟，獲得了一種熱穩(wěn)定的抗凍蛋白，并研究了其對(duì)冷凍面團(tuán)超微結(jié)構(gòu)的影響。尉姍姍等[17]將新疆沙冬青葉片配合液氮用攪拌機(jī)打磨至粉狀，加入緩沖液混勻，高速離心，取上清液后超濾脫脂；然后，將脫脂后的樣品，用美國(guó)Bio-Rad公司的雙流速層析系統(tǒng)進(jìn)行DE-52離子交換柱進(jìn)行層析分離，NaCl梯度洗脫后收集各洗脫峰；最后經(jīng)脫鹽、冷凍干燥，得到相對(duì)分子質(zhì)量為119 24的抗凍蛋白。Simpson等[20]將連翹的蛋白質(zhì)提取液依次經(jīng)過(guò)陰離子交換柱、羥基磷灰石色譜和凝膠過(guò)濾進(jìn)行分離純化，獲得了一種相對(duì)分子質(zhì)量為20 000的抗凍蛋白。王維香等[21]將沙冬青提取液依次經(jīng)過(guò)熱處理、弱陰離子交換層析 （DEAE-cellulose A52）、凝膠過(guò)濾層析（Sephacryl S300）、 疏 水 高 效 液 相 層 析 （Poros 20HP2）和強(qiáng)陰離子高效液相交換層析（Sourcel5Q），分離純化到抗凍蛋白amAFP28。

傳統(tǒng)層析方法存在分離周期長(zhǎng)、過(guò)程繁瑣、得率低、分離工藝不穩(wěn)定和重復(fù)性差等缺點(diǎn)，并且在大規(guī)模生產(chǎn)中，由于耗資昂貴不能使產(chǎn)品維持合理的價(jià)格。另外，利用硫酸銨或乙醇分級(jí)沉淀法來(lái)純化抗凍蛋白，硫酸銨或乙醇可能會(huì)改變活性潛伏的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，造成抗凍活性的損失。

2 SDS-PAGE電泳分離方法

SDS-PAGE電泳分離方法是將具有熱滯活性的抗凍蛋白的電泳條帶進(jìn)行切割分離，該方法步驟少、時(shí)間短，適用于高精度和高純度抗凍蛋白樣品純化。Hon等[12]對(duì)冬黑麥非質(zhì)體提取液進(jìn)行SDSPAGE電泳，然后直接回收凝膠上的抗凍蛋白。Wang等[22]則首先采用經(jīng)典的蛋白質(zhì)色譜技術(shù)來(lái)分離沙冬青葉片中的抗凍蛋白質(zhì)，然后經(jīng)非變性PAGE膠分離、回收，得到具有熱滯活性的抗凍蛋白的條帶。Zhang等[23]則采用SDS-PAGE電泳電泳條帶切割法與柱層析分離相結(jié)合的方法獲得了冬小麥麩皮抗凍蛋白。

然而，SDS-PAGE電泳分離過(guò)程中，電泳分離的各峰間相互疊加，分離效率不太理想，并且分離過(guò)程有時(shí)會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀，使收集電泳組分困難。另外，該方法必須在有標(biāo)準(zhǔn)樣品的基礎(chǔ)上才可以有效地純化，純化的樣品也非常少。

3 冰特異性吸附分離方法

目前，利用抗凍蛋白對(duì)親水性表面具有自發(fā)的親和吸附能力，開(kāi)發(fā)和制備新型的吸附分離介質(zhì)開(kāi)始受到關(guān)注。例如，Kuiper等[24]根據(jù)抗凍蛋白和冰晶之間存在特異吸附性，設(shè)計(jì)了一個(gè) “冷手指（Cold Finger）”（圖 1）。樣品置于燒杯中，緩慢的磁力攪拌，保證溶液體系均勻，“冷手指”通過(guò)與其相連的管路控制溫度。該“冷手指”可以從粗提物中純化與冰結(jié)合的抗凍蛋白，使用一次就使抗凍蛋白濃度提高50倍，操作效率高。

圖1 冷手指裝置Fig.1 Cold finger device

Zhang等[25]參照Kuiper的試驗(yàn)方法，并對(duì)分離裝置進(jìn)行了改良（圖2）。首先通過(guò)熱重分析儀法和分配系數(shù)法研究證明冬小麥麩皮抗凍蛋白具有較強(qiáng)的親水性和親冰性，然后使用冰特異性親和吸附法對(duì)其純化，獲得了產(chǎn)率為1.64%的電泳純小麥麩皮抗凍蛋白。

圖2 冰特異性吸附分離小麥麩皮抗凍蛋白Fig.2 Separation antifreeze proteins from wheat bran（Triticum aestivum L.） by ice specific adsorption

劉尚等[26]根據(jù)抗凍蛋白與冰結(jié)合的特性，利用碎冰從女貞葉提取液中分離出抗凍蛋白。結(jié)果表明，通過(guò)碎冰吸附、凝膠過(guò)濾和離子交換層析可以獲得4個(gè)組分的蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)差式掃描量熱儀鑒定，其中的1個(gè)具有熱滯活性。

Gupta等[27]也使用類似的方法來(lái)分離沙棘中的抗凍蛋白。首先通過(guò)二維電泳、質(zhì)譜和冰晶修飾活性鑒定出沙棘提取液中含有抗凍蛋白，進(jìn)而通過(guò)冰特異性親和吸附法對(duì)沙棘抗凍蛋白進(jìn)行了制備純化（圖 3）。

冰特異性吸附分離法利用了抗凍蛋白對(duì)冰的特異吸附性，經(jīng)一步分離步驟即可使植物抗凍蛋白的純化倍數(shù)顯著提高，比傳統(tǒng)的色譜方法更加快捷高效；但是該方法對(duì)純化過(guò)程的控制要求嚴(yán)格，目前的分離裝置還比較復(fù)雜。隨著蛋白質(zhì)分離純化設(shè)備的發(fā)展與改進(jìn)，該方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖3 沙棘抗凍蛋白的分離純化Fig.3 Separation and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides

4 濁點(diǎn)萃取方法

濁點(diǎn)萃?。–loud-Point Extraction，CPE）是近年來(lái)在分離科學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的一種新穎分離方法，它不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑，不影響環(huán)境。它利用非離子表面活性劑水溶液在加熱到濁點(diǎn)溫度時(shí)形成界面清晰的膠束/水兩相（圖4），而組分可在兩相中進(jìn)行分配來(lái)實(shí)現(xiàn)分離[28-31]。濁點(diǎn)系統(tǒng)可基于包括脂肪酸聚氧乙烯醚和烷基酚聚氧乙烯醚系列，以及烷氧基嵌段共聚物類化合物等。CPE法具有經(jīng)濟(jì)、安全、高效、操作簡(jiǎn)便、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

圖4 非離子表面活性劑的濁點(diǎn)相分離Fig.4 Cloud pointphase separation of nonionic surfactants

作者首次將濁點(diǎn)萃取法用于冬小麥抗凍蛋白的分離純化[32]。首先采用含非離子表面活性劑的緩沖溶液從冬小麥和女真葉中的浸取抗凍蛋白；然后加熱到濁點(diǎn)溫度后分成水相和膠束相兩相，疏水性雜質(zhì)富集于膠束相，而親水性的抗凍保留在水相；最后經(jīng)透析濃縮、冷凍干燥得到純化的抗凍蛋白產(chǎn)品。應(yīng)用SDS-PAGE和差示掃描量熱儀（DSC）分別測(cè)定了其相對(duì)分子質(zhì)量范圍和熱滯活性值?？箖龅鞍紫鄬?duì)分子質(zhì)量范圍為20 200～66 100，熱滯活性范圍為0.20～0.38℃，濁點(diǎn)萃取過(guò)程對(duì)抗凍蛋白的熱滯活性不產(chǎn)生顯著影響?？箖龅鞍子捎诰哂泻軓?qiáng)的親水性將保留在水相，而疏水性雜質(zhì)選擇性地萃取到膠束相，這是濁點(diǎn)萃取純化抗凍蛋白的基礎(chǔ)。另外，還研究了凈電荷、相對(duì)分子質(zhì)量不同的女貞葉抗凍蛋白在SDS/Triton X-114雙水相系統(tǒng)的的分配行為[32]。其分配行為受膠束與抗凍蛋白的體積排阻作用而影響，而蛋白凈電荷作用對(duì)其分配無(wú)顯著影響?？箖龅鞍椎姆峙湎禂?shù)與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、SDS質(zhì)量濃度和溫度呈正相關(guān)性，其值在1.56～9.51之間；隨著SDS質(zhì)量濃度和溫度的增加，表面活性劑聚集體的尺寸增加，膠束相對(duì)抗凍蛋白的體積排阻增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)其相水相轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果表明:濁點(diǎn)萃取法的表面活性劑用量少、成本低、體系組成簡(jiǎn)單，是一種極具潛力的抗凍蛋白分離方法。

5 展望

目前，大多數(shù)研究重點(diǎn)均集中在新抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)及分析上，而對(duì)其分離制備過(guò)程的關(guān)鍵技術(shù)則研究較少。另外，抗凍蛋白的分離純化方法研究主要還局限在實(shí)驗(yàn)室分析規(guī)模，將其發(fā)展到對(duì)抗凍蛋白的大規(guī)模分離純化還面臨著許多問(wèn)題和挑戰(zhàn)。例如，如何篩選出對(duì)抗凍蛋白具有特異性作用的功能基團(tuán)，抗凍蛋白與分離介質(zhì)間如何相互作用、怎樣匹配，等等。因此，有必要對(duì)這些科學(xué)問(wèn)題進(jìn)行系統(tǒng)深入的基礎(chǔ)研究，揭示其內(nèi)在的科學(xué)規(guī)律和原理。

通過(guò)抗凍蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、極性、特異性冰晶吸附等性質(zhì)進(jìn)行分離方法的設(shè)計(jì)是抗凍蛋白分離方法的發(fā)展方向。特別需要指出的是，具有高度專一性和選擇性的親和分離材料的開(kāi)發(fā)應(yīng)在抗凍蛋白的分離純化中得到關(guān)注。此外，親和分離材料與表面活性劑（或聚合物）雙水相萃取體系的結(jié)合，以及與其他相關(guān)技術(shù)的集成和聯(lián)用，將促進(jìn)抗凍蛋白分離純化的規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

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