組織工程骺板軟骨治療骺板損傷的研究進(jìn)展

李文超 綜述 許瑞江 審校

解放軍總醫(yī)院 小兒外科，北京 100853

骺板是位于骨骺與干骺端之間的軟骨組織，負(fù)責(zé)長管狀骨的生長。骺板組織是長管狀骨中最薄弱部位，在各種因素作用下容易出現(xiàn)骺板損傷。然而骺板自身修復(fù)能力欠佳，損傷的骺板組織常被骨組織修復(fù)，即骨骺和干骺端之間形成骨性連接(骨橋)。根據(jù)骨橋的產(chǎn)生部位及面積可導(dǎo)致不同程度的肢體短縮和成角畸形。臨床上采用骨橋切除及各種材料填充的方法僅在治療小面積(<30%)的骺板損傷中取得了一定的臨床效果。隨著組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展，眾多研究逐漸致力于促進(jìn)骺板組織再生、防止骨橋形成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較滿意，現(xiàn)就其研究進(jìn)展綜述如下。

1 骺板組織結(jié)構(gòu)及骨橋形成

依據(jù)骺板細(xì)胞的組織形態(tài)和生物學(xué)功能將其在解剖上分為：靜止區(qū)、增殖區(qū)、肥大區(qū)和鈣化區(qū)等[1]。靜止區(qū)中含有大量前軟骨干細(xì)胞，通過增殖分化形成典型的柱狀結(jié)構(gòu)并分泌Ⅱ型膠原及蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)。之后在堿性磷酸酶、骨形態(tài)發(fā)生蛋白及甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白等多種因素共同作用下調(diào)節(jié)鈣鹽沉積，形成鈣鹽晶體向成骨方向分化，促進(jìn)肢體生長[2]。

骨橋組織的形成機(jī)制尚不清楚。早期研究認(rèn)為骨橋來源于靜止區(qū)干細(xì)胞損傷或骨骺與骺板間的紊亂。后期研究顯示在骨骺和干骺端之間的血流循環(huán)紊亂將引起骨橋組織形成。其中骨小梁表現(xiàn)為干骺端松質(zhì)骨的軟骨內(nèi)成骨的形態(tài)學(xué)和分子學(xué)的特征[3]。Lee等[4]報道骨橋來源于BMSCs向成骨細(xì)胞直接分化；未發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原、血管內(nèi)皮生長因子及其他與軟骨成骨相關(guān)的分子學(xué)特征。Xian等[5]研究顯示前成骨干細(xì)胞在細(xì)胞因子作用下向成骨方向分化，此外，白介素和腫瘤壞死因子等炎癥細(xì)胞及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、堿性成纖維生長因子(bFGF)和胰島素樣生長因子1(IGF-1)等細(xì)胞因子能降低軟骨形成轉(zhuǎn)化因子Sox-9mRNA表達(dá)以抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[6]。

2 組織工程骺板軟骨修復(fù)骺板損傷

臨床上主要采用骨橋切除，填充脂肪、肌肉和肌腱等生物材料以及骨蠟、骨水泥及多聚體硅膠等非生物材料。上述材料僅具有機(jī)械支持作用，不具備生長能力，臨床效果欠佳。組織工程技術(shù)在治療骺板損傷方面取得了良好的實(shí)驗(yàn)效果，能夠促進(jìn)骺板軟骨再生，減輕患兒肢體的畸形程度。其中包括種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞因子三個方面。

2.1 種子細(xì)胞 種子細(xì)胞包括骺板細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以間充質(zhì)干細(xì)胞等，根據(jù)來源情況分為自體細(xì)胞、同種異體細(xì)胞和異種細(xì)胞。

骺板細(xì)胞：骺板細(xì)胞具有良好的組織來源及細(xì)胞生物學(xué)功能，成為組織工程骺板的首選細(xì)胞，也是修復(fù)骺板損傷的重要保障。自體骺板細(xì)胞應(yīng)用廣泛，然而存在著來源不足及二次損傷等缺點(diǎn)；同種異體細(xì)胞來源充分，然而可能引起傳染性疾病或者免疫排斥反應(yīng)。Bently等[7]采用同種異體骺板細(xì)胞修復(fù)骺板損傷模型，骺板細(xì)胞形成類似骺板組織的柱狀結(jié)構(gòu)。但是，有研究將骺板細(xì)胞直接植入羊脛骨骺板損傷模型，出現(xiàn)明顯的骨橋組織并伴有炎癥反應(yīng)[8]。

關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞： 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)功能與骺板細(xì)胞相似，分泌蛋白聚糖和Ⅱ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)。Tobita等[9]采用自體膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞復(fù)合膠原凝膠植入幼兔骺板損傷模型，組織學(xué)顯示細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，防止骺板早閉的發(fā)生。Lee等[10]將軟骨細(xì)胞復(fù)合瓊脂糖修復(fù)骺板損傷，影像學(xué)顯示肢體生長阻滯及成角畸形得到明顯糾正。然而，關(guān)節(jié)軟骨不具備骺板組織的多層柱狀結(jié)構(gòu)，長時間體外培養(yǎng)和傳代過程中難以維持細(xì)胞表型，容易出現(xiàn)細(xì)胞老化現(xiàn)象。

間充質(zhì)干細(xì)胞： 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一系列具有多向分化潛能、自身再生的細(xì)胞，來源于骨髓、滑膜、骨骼肌和脂肪組織。MCSs形成集落成纖維細(xì)胞，還表達(dá)眾多細(xì)胞表面蛋白和標(biāo)記(CD44，CD71，CD90，CD105，CD120a，CD124以及CD166)。骨髓、骨膜和脂肪來源的MSCs植入幼兔骺板損傷模型中，影像學(xué)顯示脛骨的成角畸形得到明顯糾正[11]。Yoo等[12]將軟骨膜干細(xì)胞誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞復(fù)合纖維蛋白球植入幼兔脛骨骺板缺損模型，可見簇狀的類軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Chen等[13]將BMSCS復(fù)合瓊脂糖凝膠植入骺板損傷模型，組織學(xué)顯示MSCs具有軟骨分化潛能，形成柱狀結(jié)構(gòu)的類骺板組織，脛骨短縮及成角畸形得到明顯改善。

2.2 支架材料 支架材料是種子細(xì)胞的生存環(huán)境和代謝場所，其組織結(jié)構(gòu)和功能變化直接影響組織工程骺板的生物學(xué)功能。充填劑復(fù)合物或支架材料為種子細(xì)胞提供三維依附支架和力學(xué)環(huán)境，刺激MSCs的生長及向軟骨方向分化，使種子細(xì)胞均勻分布及促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。此外，支架材料填充骺板缺損能夠延緩骨橋發(fā)生。

細(xì)胞基質(zhì)材料分為天然支架、人工合成支架及兩者的復(fù)合物，包括藻酸鹽、膠原、聚乙醇酸、聚乳酸、透明質(zhì)烷、聚殼糖、膠原-氨基葡萄糖聚合物、聚乳酸-透明質(zhì)烷聚合物、透明質(zhì)烷-殼聚糖復(fù)合水凝膠等。此外，可注射性或體內(nèi)原位交聯(lián)、聚合的材料也是良好的細(xì)胞攜帶材料及缺損填充支架，如瓊脂糖、膠原、殼聚糖、藻酸鈣和透明質(zhì)烷。瓊脂糖以良好的生物學(xué)功能在組織工程中得到廣泛應(yīng)用，瓊脂糖能夠促進(jìn)骺板細(xì)胞進(jìn)行整合修復(fù)、相互依附。瓊脂糖凝膠復(fù)合骺板細(xì)胞能夠修復(fù)骺板損傷模型，糾正肢體短縮及成角畸形[10]。

纖維蛋白凝膠源于血漿纖維蛋白原的交聯(lián)結(jié)合作用，模擬生理凝血過程。纖維蛋白凝膠價格便宜、可降解，能夠促進(jìn)細(xì)胞和基質(zhì)材料的同源性混合，且已獲得批準(zhǔn)在臨床上廣泛應(yīng)用。纖維蛋白原和凝血酶的結(jié)合比例決定了纖維蛋白凝膠的微環(huán)境以及植入的MSCs的擴(kuò)展速度、增殖及分化情況[14]。由于纖維蛋白的溶解作用，其穩(wěn)定性欠佳，常需要聯(lián)合應(yīng)用抑肽酶等纖維蛋白溶解抑制劑以增加體內(nèi)試驗(yàn)的穩(wěn)定性和效力。抑肽酶能夠通過促進(jìn)糖胺聚糖及Ⅱ型膠原的表達(dá)來提高BMSCs的軟骨誘導(dǎo)作用，而且纖維蛋白凝膠支持TGF-β1的軟骨誘導(dǎo)作用。

殼聚糖具有可降解性、良好的生物相容性以及促進(jìn)組織愈合等特點(diǎn)，為細(xì)胞提供三維培養(yǎng)環(huán)境，能夠維持骺板細(xì)胞表型、防止細(xì)胞老化、促進(jìn)細(xì)胞增殖及合成細(xì)胞外基質(zhì)。殼聚糖作為MSCs的支架材料有效地修復(fù)幼兔50%的骺板組織缺損，維持骺板組織開放[15]。透明質(zhì)烷是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，能夠維持軟骨結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)功能的完整性。透明質(zhì)烷能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、新陳代謝、生物合成以及凋亡，并且抑制破壞性的炎癥細(xì)胞及蛋白酶的表達(dá)[16]。種子細(xì)胞黏附在透明質(zhì)烷表面分泌細(xì)胞外基質(zhì)，植入體內(nèi)不產(chǎn)生任何炎癥反應(yīng)，且在4個月內(nèi)完全降解。

不同支架材料聯(lián)合應(yīng)用與單獨(dú)支架相比具有明顯的優(yōu)勢。例如：多糖藻酸鈣凝膠能夠提高TGF-β促進(jìn)MSCs軟骨誘導(dǎo)作用；透明質(zhì)烷和海藻酸鈣復(fù)合具有劑量依賴性提高軟骨方向的誘導(dǎo)作用[17]。醋化透明質(zhì)酸和蛋白凝膠復(fù)合支架促進(jìn)骺板細(xì)胞增殖、分化及分泌細(xì)胞外基質(zhì)。透明質(zhì)酸和明膠復(fù)合的水凝膠具有良好的生物相容性以及軟骨誘導(dǎo)作用，能夠模擬軟骨外基質(zhì)的天然環(huán)境。可注射性的交聯(lián)凝膠易于使用，能夠填充各種不同形狀的缺損部位[18]。

2.3 細(xì)胞因子 細(xì)胞因子包括TGF-βs、IGF、bFGF、VEGF及PDGF等，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及生物學(xué)行為方面起著關(guān)鍵性作用。而且細(xì)胞因子在促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞方向分化以及細(xì)胞生物治療方面同樣發(fā)揮著重要作用[19]。TGF-β能夠刺激MSCs向軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)Ⅱ型膠原和糖胺聚糖等軟骨基質(zhì)分子的表達(dá)；而且促進(jìn)MSCs合成蛋白聚糖、接合蛋白、纖維調(diào)節(jié)、低聚物基質(zhì)蛋白及核心蛋白多糖等軟骨細(xì)胞外基質(zhì)[20]。BMP-2在骺板周圍軟骨膜以及肥大區(qū)中高度表達(dá)，能夠誘導(dǎo)Ⅱ型膠原基因的表達(dá)；BMP-4在體外實(shí)驗(yàn)中能夠提高肌肉來源的干細(xì)胞向成骨分化的作用[21]。IGF促進(jìn)骺板細(xì)胞成熟及合成細(xì)胞外基質(zhì)，還具有抑制骺板細(xì)胞肥大，維持骺板細(xì)胞表型的作用[22]。此外，骺板細(xì)胞聯(lián)合IGF植入軟骨缺損區(qū)域能夠促進(jìn)修復(fù)組織形態(tài)學(xué)及生物機(jī)械方面的改善[23]。VEGF在肥大區(qū)細(xì)胞中高度表達(dá)，觸發(fā)了骺板細(xì)胞鈣鹽沉積以及促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和干骺端的血管侵入[24]。TGF-β和IGF-1聯(lián)合應(yīng)用能夠在植入或內(nèi)在MSCs中發(fā)揮有潛力的雙重促進(jìn)作用。高濃度的IGF-1能夠提高TGF-β1誘導(dǎo)滑膜纖維組織中MSCs的軟骨分化作用。

3 展望

組織工程骺板在治療骺板損傷方面取得了一定的實(shí)驗(yàn)效果，然而仍存在著諸多問題有待進(jìn)一步探索和研究，具體主要有以下幾個方面：1)缺乏統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)：在不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施過程中，對于骺板損傷的面積、部位及觀察時間缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，對修復(fù)結(jié)果以及對照評定仍需進(jìn)一步完善。2)支架材料的選擇：支架材料是組織工程骺板技術(shù)成功的關(guān)鍵，良好的支架材料應(yīng)具有良好組織相容性、合適的孔隙率、可降解性、三維立體結(jié)構(gòu)、良好的材料-細(xì)胞界面、可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度。3)細(xì)胞因子的應(yīng)用：細(xì)胞因子在體內(nèi)的各種信號途徑發(fā)揮各種生物學(xué)作用，然而外源性的細(xì)胞因子價格昂貴限制了實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。軟骨細(xì)胞內(nèi)源性細(xì)胞因子以及細(xì)胞因子緩釋作用或?qū)⒊蔀檠芯拷裹c(diǎn)。4)構(gòu)建良好的組織工程骺板：體外構(gòu)建具有正常結(jié)構(gòu)的組織工程骺板組織，同時維持骺板細(xì)胞的各種生理功能達(dá)到修復(fù)骺板損傷的目的將成為眾多學(xué)者的研究方向。

1 Belluoccio D， Etich J， Rosenbaum S， et al. Sorting of growth plate chondrocytes allows the isolation and characterization of cells of a defined differentiation status［J］. J Bone Miner Res， 2010， 25（6）：1267-1281.

2 Zhang D， Schwarz EM， Rosier RN， et al. ALK2 functions as a BMP type I receptor and induces Indian hedgehog in chondrocytes during skeletal development［J］. J Bone Miner Res， 2003， 18（9）：1593-1604.

3 Ferguson C， Alpern E， Miclau T， et al. Does adult fracture repair recapitulate embryonic skeletal formation?［J］. Mech Dev， 1999，87（1-2）： 57-66.

4 Lee MA， Nissen TP， Otsuka NY. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation［J］.J Pediatr Orthop， 2000， 20（6）： 802-806.

5 Xian CJ， Zhou FH， Mccarty RC， et al. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site［J］. J Orthop Res， 2004， 22（2）： 417-426.

6 Macsai CE， Hopwood B， Chung R， et al. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area［J］. Bone，2011， 49（4）： 904-912.

7 Bentley G， Greer RB 3rd. Homotransplantation of isolated epiphyseal and articular cartilage chondrocytes into joint surfaces of rabbits［J］.Nature， 1971， 230（5293）： 385-388.

8 Hansen AL， Foster BK， Gibson GJ， et al. Growth-plate chondrocyte cultures for reimplantation into growth-plate defects in sheep.Characterization of cultures［J］. Clin Orthop Relat Res， 1990（256）：286-298.

9 Tobita M， Ochi M， Uchio Y， et al. Treatment of growth plate injury with autogenous chondrocytes： a study in rabbits［J］. Acta Orthop Scand， 2002， 73（3）：352-358.

10 Lee EH， Chen F， Chan J， et al. Treatment of growth arrest by transfer of cultured chondrocytes into physeal defects［J］. J Pediatr Orthop，1998， 18（2）： 155-160.

11 Hui JH， Li L， Teo YH， et al. Comparative study of the ability of mesenchymal stem cells derived from bone marrow， periosteum， and adipose tissue in treatment of partial growth arrest in rabbit［J］.Tissue Eng， 2005， 11（5-6）： 904-912.

12 Yoo WJ， Choi IH， Chung CY， et al. Implantation of perichondriumderived chondrocytes in physeal defects of rabbit tibiae［J］. Acta Orthop， 2005， 76（5）： 628-636.

13 Chen F， Hui JH， Chan WK， et al. Cultured mesenchymal stem cell transfers in the treatment of partial growth arrest［J］. J Pediatr Orthop， 2003， 23（4）： 425-429.

14 Huang NF， Chu J， Lee RJ， et al. Biophysical and chemical effects of fibrin on mesenchymal stromal cell gene expression［J］. Acta Biomater， 2010， 6（10）： 3947-3956.

15 Li L， Hui JH， Goh JC， et al. Chitin as a scaffold for mesenchymal stem cells transfers in the treatment of partial growth arrest［J］. J Pediatr Orthop， 2004， 24（2）： 205-210.

16 Suwannaloet W， Laupattarakasem W， Sukon P， et al. Combined effect of subchondral drilling and hyaluronic acid with/without diacerein in full-thickness articular cartilage lesion in rabbits［J］.ScientificWorldJournal， 2012：310745. ［Epub］

17 Kavalkovich KW， Boynton RE， Murphy JM， et al. Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells within an alginate layer culture system［J］. In Vitro Cell Dev Biol Anim， 2002， 38（8）：457-466.

18 Guo X， Park H， Young S， et al. Repair of osteochondral defects with biodegradable hydrogel composites encapsulating marrow mesenchymal stem cells in a rabbit model［J］. Acta Biomater，2010， 6（1）： 39-47.

19 Vinatier C， Bouffi C， Merceron C， et al. Cartilage tissue engineering： towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy［J］. Curr Stem Cell Res Ther， 2009， 4（4）： 318-329.

20 Huang AH， Stein A， Tuan RS， et al. Transient exposure to transforming growth factor beta 3 improves the mechanical properties of mesenchymal stem cell-laden cartilage constructs in a densitydependent manner［J］. Tissue Eng Part A， 2009， 15（11）：3461-3472.

21 Carpenter RS， Goodrich LR， Frisbie DD， et al. Osteoblastic differentiation of human and equine adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells when BMP-2 or BMP-7 homodimer genetic modification is compared to BMP-2/7 heterodimer genetic modification in the presence and absence of dexamethasone［J］. J Orthop Res， 2010， 28（10）： 1330-1337.

22 Longobardi L， Li T， Myers TJ， et al. TGF-β type II receptor/MCP-5 axis： at the crossroad between joint and growth plate development［J］.Dev Cell， 2012， 23（1）： 71-81.

23 Fortier LA， Mohammed HO， Lust G， et al. Insulin-like growth factor-I enhances cell-based repair of articular cartilage［J］. J Bone Joint Surg Br， 2002， 84（2）： 276-288.

24 Ishijima M， Suzuki N， Hozumi K， et al. Perlecan modulates VEGF signaling and is essential for vascularization in endochondral bone formation［J］. Matrix Biol， 2012， 31（4）： 234-245.