體外三維腫瘤模型的研究進(jìn)展

孫培鳴 綜述 徐迎新，李 榮 審校

解放軍總醫(yī)院 普通外科研究所，北京 100853

腫瘤生物學(xué)行為及治療方法的體外研究一般多采用腫瘤細(xì)胞系的平面培養(yǎng)模型(monolayer cultures)，然而實(shí)體腫瘤在體內(nèi)以三維立體模式生長，腫瘤細(xì)胞不僅相互接觸還與其支撐結(jié)構(gòu)—細(xì)胞外基質(zhì)接觸[1-2]。研究表明，單個(gè)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為受直接接觸的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的影響[3]。三維模式下的細(xì)胞微環(huán)境、細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用能顯著的影響分泌、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移等細(xì)胞功能[4-5]。因此，盡管平面模型在腫瘤體外研究中取得了一些進(jìn)展，但其不能完全反映體內(nèi)實(shí)體腫瘤的真實(shí)情況。三維細(xì)胞培養(yǎng)模型(three-dimensional cell culture)的發(fā)展為解決上述問題提供了良好的方法。三維細(xì)胞培養(yǎng)模型能在體外構(gòu)建與體內(nèi)相近的細(xì)胞生長系統(tǒng)，較好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，可用于腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為及治療方面的研究。現(xiàn)對(duì)三維腫瘤模型的構(gòu)建方法及主要應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 構(gòu)建方法

1.1 振蕩法 振蕩法是構(gòu)建三維腫瘤模型的常用和經(jīng)典方法[6]。主要包括以下幾種方式：旋轉(zhuǎn)管(roller tube)、振蕩瓶(spinner flask)和單程回轉(zhuǎn)震蕩器(gyratory shaker)。該方法主要通過振蕩等外來作用力阻止腫瘤細(xì)胞貼壁形成球狀體，可應(yīng)用于大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞。其主要步驟為，取平面培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，放于含適宜培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。然后在培養(yǎng)瓶中放入轉(zhuǎn)子，或?qū)⑴囵B(yǎng)瓶放在振蕩器/旋轉(zhuǎn)器上。再把培養(yǎng)瓶或振蕩器/旋轉(zhuǎn)器放于配有空氣/CO2平衡裝置的培養(yǎng)箱中，維持轉(zhuǎn)子、振蕩器或旋轉(zhuǎn)器的震蕩或旋轉(zhuǎn)。1~3 d后懸浮的腫瘤細(xì)胞可相互聚集形成球狀體，期間需部分更換培養(yǎng)基以維持足夠的營養(yǎng)。待球狀體達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需大小時(shí)取出，備用。該方法優(yōu)點(diǎn)是能夠制備大量的腫瘤球狀體，缺點(diǎn)是利用外力形成球狀體，與體內(nèi)腫瘤的生長情況不相符，且不同細(xì)胞形成的球狀體密度和體積有較大差異。旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器(NASA bioreactor)由震蕩/旋轉(zhuǎn)法發(fā)展而來，這種裝置能夠培養(yǎng)復(fù)雜的腫瘤球狀體，且能自動(dòng)更換培養(yǎng)基提供持續(xù)的營養(yǎng)，但因價(jià)格較昂貴使其應(yīng)用受到一定限制[7]。

1.2 液態(tài)鋪板法 液態(tài)鋪板法也是構(gòu)建三維腫瘤模型常用的方法[8-9]。瓊脂、膠原等液態(tài)生物材料常用來預(yù)先鋪板，包被培養(yǎng)皿。取平面培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞接種在包被后的培養(yǎng)皿上，包被材料可阻止細(xì)胞貼壁生長。幾天后，腫瘤細(xì)胞相互聚集，形成大小不等的類圓形聚集體。待腫瘤聚集體形態(tài)較規(guī)則時(shí)，將其移至另一包被后的培養(yǎng)皿中，定期更換培養(yǎng)基。當(dāng)達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需大小時(shí)，去除形態(tài)不規(guī)則的聚集體，備用。這種方法適于在96孔板中建立三維腫瘤模型，可用于大規(guī)模高通量的篩選抗腫瘤藥物。

1.3 膠滴法 膠滴法構(gòu)建的三維腫瘤模型多用于抗腫瘤藥物的篩選，被稱為CD-DST(collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test)。取平面培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，液態(tài)膠原溶液重懸。用移液管或滴管將腫瘤細(xì)胞/膠原混合液滴于培養(yǎng)皿，每滴約30~50μl，再將培養(yǎng)皿放于培養(yǎng)箱，膠滴凝固后添加培養(yǎng)基。及時(shí)更換培養(yǎng)基，待膠原凝膠內(nèi)腫瘤細(xì)胞聚集生長形成腫瘤球后進(jìn)行后續(xù)的藥敏試驗(yàn)[10-11]。

1.4 組織工程方法 組織工程技術(shù)傳統(tǒng)上應(yīng)用于組織再生與創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域，較少用于構(gòu)建體外三維腫瘤模型。組織工程領(lǐng)域研究表明，種子細(xì)胞植入支架材料后形成的三維結(jié)構(gòu)能夠比平面模型更好的模擬體內(nèi)組織，特別是在模擬體內(nèi)細(xì)胞間和細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用方面[12]。組織工程支架材料，如膠原、瓊脂等為多孔樣結(jié)構(gòu)，能夠?yàn)榧?xì)胞黏附、細(xì)胞與支架相互作用提供巨大的表面積，還能為細(xì)胞遷徙和營養(yǎng)物質(zhì)的滲透提供通道[13]。目前，少量利用組織工程材料的研究多集中在抗腫瘤藥物的篩選方面。

2 三維腫瘤模型在腫瘤研究中的應(yīng)用

2.1 腫瘤侵襲性及轉(zhuǎn)移的研究 三維腫瘤模型在腫瘤生物學(xué)中的主要應(yīng)用之一就是觀察腫瘤細(xì)胞立體狀態(tài)下的浸潤和侵襲。Schor等較早利用人子宮頸癌Hela細(xì)胞、敘利亞田鼠黑色素瘤細(xì)胞和膠原凝膠建立了腫瘤立體生長模型，凝膠中腫瘤細(xì)胞生長良好，可向膠原基質(zhì)中浸潤[14]。近期研究中，Chignola等建立了三維腫瘤培養(yǎng)的數(shù)學(xué)物理模型，可定量分析測(cè)定藥物及環(huán)境等因素對(duì)腫瘤細(xì)胞遷徙能力、遷徙方向及移動(dòng)動(dòng)力等因素的影響[15]。研究還發(fā)現(xiàn)，體外構(gòu)建的三維腫瘤模型移植入體內(nèi)也能夠產(chǎn)生侵襲和轉(zhuǎn)移。如Tang等將體外構(gòu)建的三維肝癌模型植入動(dòng)物體內(nèi)肝臟原位，發(fā)現(xiàn)可形成原位腫瘤并有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16]。

2.2 腫瘤壞死及凋亡機(jī)制的研究 三維腫瘤模型中腫瘤細(xì)胞多聚集成團(tuán)生長，而團(tuán)塊中心區(qū)域的細(xì)胞存在缺少氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)及物質(zhì)代謝、廢物處理等問題。這與體內(nèi)實(shí)體腫瘤中心區(qū)域細(xì)胞的病理特征相似。早期研究表明，三維腫瘤模型中細(xì)胞壞死的主要因素包括：培養(yǎng)基質(zhì)中氧含量和營養(yǎng)物質(zhì)的減少、pH值的改變及腫瘤壞死區(qū)域廢棄物質(zhì)的累積[17]。近期研究進(jìn)一步證實(shí)腫瘤細(xì)胞壞死核的形成過程中并不伴有能量代謝的變化。腫瘤細(xì)胞凋亡方面的研究表明，三維腫瘤模型比平面模型表現(xiàn)出更高的抵抗缺氧、放療及化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能力。Kim等構(gòu)建了U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞和U87星形細(xì)胞瘤細(xì)胞三維腫瘤模型，并研究了缺氧條件下與平面模型在細(xì)胞凋亡方面的差異。實(shí)驗(yàn)證實(shí)三維腫瘤模型可通過上調(diào)抗凋亡蛋白BCL-2等表現(xiàn)出更高的抗凋亡能力[18]。放療方面，Dangles等研究了放療導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡在膀胱癌細(xì)胞平面培養(yǎng)模型和三維培養(yǎng)模型中的差異。研究發(fā)現(xiàn)，三維腫瘤模型中表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)可通過激活其受體來抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[19]。化療方面，F(xiàn)rankel等研究了化療藥物紫杉醇引起的人卵巢癌細(xì)胞凋亡在平面培養(yǎng)和三維培養(yǎng)中的不同。實(shí)驗(yàn)表明，在紫杉醇作用下，平面培養(yǎng)模型中的腫瘤細(xì)胞較多處于G2-M期，與三維培養(yǎng)相比有更多的細(xì)胞凋亡[20]。研究者認(rèn)為這與平面培養(yǎng)模型和三維培養(yǎng)模型中細(xì)胞排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的差異等因素有關(guān)。

2.3 實(shí)體腫瘤治療方法的研究 腫瘤治療方法的研究一般都基于平面培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系。但是臨床實(shí)踐中，常發(fā)現(xiàn)體外研究中有效的治療方法與患者體內(nèi)實(shí)際臨床療效有較大差異，故平面模型在預(yù)測(cè)腫瘤治療方法的臨床應(yīng)用方面價(jià)值有限。而三維腫瘤模型與體內(nèi)實(shí)體腫瘤均呈三維立體生長，能夠較好地模擬實(shí)體腫瘤的三維空間結(jié)構(gòu)及腫瘤微環(huán)境。

早期研究中，Nederman和Kobayashi等證明腫瘤細(xì)胞系在三維生長模型中大多表現(xiàn)出比平面培養(yǎng)更強(qiáng)的抗藥性，且三維腫瘤模型中腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性與體內(nèi)相似[21-22]。Orlandi等比較了伊達(dá)比星和伊達(dá)比星醇在MCF-7乳腺癌細(xì)胞平面培養(yǎng)與三維立體培養(yǎng)中療效的不同。研究發(fā)現(xiàn)三維模型中腫瘤細(xì)胞的耐藥性與藥物作用時(shí)間有關(guān)，推測(cè)腫瘤細(xì)胞耐藥性的增高與三維立體排列方式導(dǎo)致的藥物作用延遲和分布不均相關(guān)[23]。Horning等比較了阿霉素，紫杉醇和他莫昔芬3種藥物在MCF-7乳腺癌細(xì)胞平面培養(yǎng)與三維立體培養(yǎng)中的不同。研究發(fā)現(xiàn)不同藥物對(duì)腫瘤球的作用明顯不同，而且相同藥物在腫瘤球不同增值時(shí)期藥效也不同[24]。由此可見腫瘤細(xì)胞三維生長狀態(tài)可顯著地改變化療效果，建立基于三維腫瘤模型的藥物篩選平臺(tái)有助于發(fā)現(xiàn)并篩選具有臨床應(yīng)用價(jià)值的化療藥物。

三維腫瘤模型中腫瘤細(xì)胞呈立體狀態(tài)生長，能夠較好地模擬體內(nèi)免疫細(xì)胞的遷移及腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的相互作用。免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等)一般以細(xì)胞懸液的形式加入腫瘤球狀體培養(yǎng)基中，觀察三維腫瘤微環(huán)境對(duì)免疫細(xì)胞遷徙、活化、成熟及殺傷等功能的影響。Spoettl等利用HT29結(jié)腸癌細(xì)胞球狀體模型研究炎癥趨化因子的過度表達(dá)對(duì)單核細(xì)胞遷徙的影響，發(fā)現(xiàn)炎癥趨化因子MCP-1可誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移到腫瘤球中[25-26]。Silzle和Gottfried等利用人黑色素瘤細(xì)胞球狀體研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸鹽可抑制DC細(xì)胞的分化和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTL)的殺傷功能[27-28]。故三維模型中腫瘤細(xì)胞的立體排列方式、細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞功能的改變可影響免疫細(xì)胞遷徙、殺傷等功能，利用三維腫瘤模型可深入研究免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用。

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