Skp 2和P27kip1蛋白在非霍奇金淋巴瘤組織中的表達及意義

王在峰 郭 蕊

1.菏澤家政職業學院，山東單縣 274300；2.山東省單縣中心醫院，山東單縣 274300

非霍奇金淋巴瘤（NHL）在我國的發病率較高，影響其預后的因素有很多，如年齡、全身狀態、國際預后指數（IPI）、Ann-Arbor分期、ps評分等。近些年來研究發現，除了上述臨床因素，仍有一些其他的因素影響NHL患者的預后。S激酶相關蛋白2（Skp2）和P27kip1蛋白在NHL組織中的表達逐漸引起國內外學者的關注。Skp2是細胞增殖周期中的一個重要因子，主導細胞周期從G1期進入S期的轉化。 P27kip1是一種抑癌基因，對細胞增殖起負性調節作用，在腫瘤患者中其表達水平多異常。Skp2、P27kip1在NHL中的表達國內外均有相關報道，通過檢測Skp2、P27kip1在NHL患者中的表達，分析其預后狀況，可以指導患者的臨床治療。本文通過免疫組化法檢測Skp2、P27kip1在NHL患者中的表達情況，并對42例NHL患者進行臨床隨訪，獲得了比較詳細的臨床資料，分析二者的相關性及對臨床預后的影響，為判斷患者的病情及預后提供新的參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究收集山東省單縣正大醫院2005年7月～2010年7月42例資料比較完善的NHL患者的臨床資料，均經病理證實，有免疫組化病理標本，取材均為腫瘤組織，并于病理科收集患者石蠟標本。入組患者中，男26例，女16例，年齡27～71歲，中位年齡58歲；根據Ann-Arbor分期標準進行分期，Ⅰ期 20例，Ⅱ期 16例，Ⅲ～Ⅳ期 6例；IPI：0分14例，1分20例，≥2分8例；病理類型：B淋巴細胞型28例，T淋巴細胞型9例，其他5例。

1.2 治療方法

全組NHL患者均采用化療，化療方案主要為CHOP方案（環磷酰胺、阿霉素或表阿霉素、長春新堿、激素），每21天為1個化療周期，部分采用其他化療方案 （COP、ECHOP或R-CHOP）。化療期間患者主要出現惡心、嘔吐、腹瀉、納差等消化道癥狀，貧血、白細胞、血小板下降等骨髓抑制反應，或伴有脫發，嚴重者可能出現多臟器功能損害，臨床上給予對癥處理，化療后多數患者癥狀逐漸緩解。

1.3 檢測方法

首先查閱42例NHL患者的原始病案登記資料，根據病理登記號及原始病理申請單，查找到患者最原始HE切片的記錄結果，然后找到所需的石蠟塊。用切片機進行蠟塊切片，切片厚度為4 μm，連續切片4張，置于60°C烤箱1 h備用。實驗操作按鼠Streptavidin-HRP免疫組化染色試劑盒說明書進行。鼠抗Skp2抗體工作液和鼠抗P27抗體工作液均購自北京中杉生物制劑有限公司，其他試劑購自華澤生物試劑有限公司。

1.4 染色判斷標準

Skp2蛋白陽性為細胞漿內出現棕黃色顆粒；P27kip1蛋白陽性表達為細胞核內出現棕黃色顆粒。以試劑盒所帶的陽性切片進行免疫組化染色，作為陽性對照；以生理鹽水代替一抗行免疫組化染色，作為陰性對照。

1.5 隨訪

所有患者進行電話隨訪，隨訪截至2010年12月31日，隨訪中位時間為40個月。總生存時間是指從疾病確診日期至患者死于任何疾病、最后隨診或截止觀察日期。無病生存時間指治療后達臨床完全緩解（CR）之日至腫瘤復發進展、最后隨診或截止觀察日期。截至最后隨診時間全組死亡15例。

1.6 統計學方法

全部數據采用SPSS 13.0軟件包行生存分析，Kaplan-Meier法計算生存率，Cox模型進行單因素和多因素分析，計數資料Skp2、P27kip1蛋白陽性率比較采用χ2檢驗，相關分析采用Spearman等級法。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 生存情況

全組死亡15例，3、5年生存率分別為 84.8%（33/42）、67.4%（25/42）；生存時間為10～112個月，中位生存時間為33個月，全組總生存曲線見圖1。

2.2 Skp2與P27kip1蛋白表達情況

在高倍鏡下Skp2與P27kip1的免疫組化陽性與陰性表達見圖2。Skp2陰性組5年總生存率為86.00%（20/33），陽性組5年生存率為53.6%（5/9），差異無統計學意義 （P=0.061）。 P27kip1陽性組 5年總生存率為 88.9%（17/20），陰性組5年生存率為45.7%（8/22），差異有統計學意義 （P=0.001）。

2.3 Skp2、P27kip1在NHL中陽性表達的相關性

采用Spearman等級法分析結果顯示，Skp2與P27kip1表達呈負性相關（r=-0.381，P=0.013）。

2.4 預后影響因素分析

對性別、年齡、全身癥狀、Ann-Arbor分期、IPI、ps評分、近期療效、Skp2及P27kip1等臨床因素進行單因素分析，結果顯示，全身癥狀（P=0.045）、Ann-Arbor分期（P=0.009）、IPI（P=0.013）、ps 評分（P=0.037）、Skp2（P=0.044）與P27kip1（P=0.001）對NHL患者的總生存率有影響。利用COX比例風險模型，進一步行多因素分析顯示，P27kip1、IPI、Ann-Arbor分期是影響NHL患者預后的獨立因素（P=0.034）。

3 討論

性的識別磷酸化底物，促使泛素-蛋白酶體途徑降解，許多細胞周期中的調控因子、轉錄因子都是通過此種途徑降解。Traub等[1]研究發現，Skp2的高表達與乳腺癌的發生、疾病進展及其臨床預后等有密切相關性，其高表達促進了惡性腫瘤細胞的增生。國內陸建明等[2]對72例B-NHL患者研究發現，Skp2在侵襲性B-NHL組的表達高于惰性BNHL組。陳燕坪等[3]對60例彌漫大B細胞淋巴瘤中Skp2的表達研究結果示，Skp2的表達與彌漫大B細胞淋巴瘤的臨床療效密切相關，Skp2的表達越強，患者的療效越差。從而表明彌漫大B細胞淋巴瘤組織中Skp2的表達，可作為指導臨床治療的參考指標，有助于改善疾病療效和預后。陸曄等[4]報道，在NHL高危患者中，Skp2多呈現高表達，并指出Skp2高表達提示NHL患者的臨床特征及預后較差。閔大六等[5]對96例彌漫大B細胞淋巴瘤患者的研究結果顯示：Skp2蛋白的表達與彌漫大B細胞淋巴瘤患者的Ann-Arbor分期、結外病灶數、全身癥狀、乳酸鹽脫氫酶（LDH）水平有顯著相關性，間接影響著患者的預后。但是本研究結果顯示，Skp2表達與NHL預后無明顯相關性，Skp2陰性組與陽性組患者5年生存率差異無統計學意義

Skp2在正常組織中表達較低或不表達，主要存在于腫瘤細胞周期的S期，其在調控細胞周期中起重要作用。Skp2作為干細胞因子（SCF）復合體的底物識別亞基，特異（P>0.05）。本研究認為，在NHL患者中Skp2的臨床表達并不能指導患者的臨床預后，但對其他惡性腫瘤的預后是否有影響尚待進一步研究。

P27kip1是一種抑癌基因，其負性調節細胞增殖，通過抑制細胞周期中各種蛋白和酶的活性，從而抑制細胞從G1期到S期的轉化，致使細胞周期停滯，不能增殖。國外報道在膀胱癌及肝內膽管癌患者中P27kip1蛋白的表達與預后密切相關，P27kip1蛋白低表達組患者的存活率顯著低于P27kip1蛋白高表達組，且P27kip1低表達的患者復發率更高，預后更差[6-10]。肖暉等[11]對NHL患者P27kip1蛋白的表達水平進行檢測，并分析其影響因素發現，NHL組織分化程度干擾P27kip1蛋白的表達。Lu等[12]應用免疫組化技術監測92例NHL患者P27kip1表達，發現P27kip1表達水平越高，NHL的增殖活性越差，腫瘤侵襲性也隨之下降，反之亦然。本研究中，P27kip1陽性組患者5年總生存率高于陰性組，差異有統計學意義（P<0.05）。P27kip1作為一種抑癌基因，其表達能抑制NHL組織細胞增殖，通過檢查它在NHL患者癌組織中的表達強弱，能預測腫瘤患者預后。P27kip1的陽性表達能提高NHL患者的生存率。

大部分研究認為，Skp2與P27kip1表達呈負性相關，但對二者表達相關性的報道仍有爭議。Katagiri等[13]研究發現，在腫瘤患者組織中Skp2蛋白的表達，造成P27kip1蛋白表達降低，從而導致細胞周期紊亂。Latres等[14]報道認為，Skp2與P27kip1蛋白表達呈負相關。但Lu等[12]研究報道認為，Skp2與P27kip1二者之間蛋白表達無明顯相關性。本研究結果顯示，在NHL患者中Skp2與P27kip1蛋白的表達呈負性相關（r=-0.381，P=0.013），可能在NHL中，Skp2蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑，使P27kip1蛋白合成途徑中的一些調控因子、轉錄因子降解，從而使P27kip1在組織中的表達減弱。

綜上所述，本研究通過免疫組化技術檢測42例NHL患者組織中Skp2和P27kip1蛋白的表達，并對二者表達情況與臨床資料及預后進行了統計學分析。研究結果表明，Skp2與P27kip1蛋白的表達在NHL中呈負性相關，P27kip1、IPI、Ann-Arbor分期是影響NHL預后的重要因素，可作為預測NHL臨床療效和判斷預后的參考指標。

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