卵黃抗體制備影響因素及其在動物生產中的應用

湖南農業大學動物科學技術學院 李玉蓮 曹滿湖 肖 勇夏 敏 龍次民 范志勇

卵黃抗體（IgY）又稱卵黃免疫球蛋白，是禽類經特異性抗原刺激由B淋巴細胞產生并移行至卵黃中的特異性抗體。由于IgY具有性質穩定、特異性強、制備成本低、制備方法簡單、可規?；a等眾多優點已被開發為一種高效的生物制劑，甚至被制成含特定抗體的飼料添加劑飼喂動物。本文就IgY制備的影響因素及其在動物生產中的應用作一綜述。

1 卵黃抗體的特性

IgY是母雞經特異性抗原刺激在孵育過程中由血清中的免疫球蛋白G（IgG）轉移到卵黃中形成的。IgY的結構呈Y字形，分子質量約為180 kD，沉降系數為7 S，由兩條重鏈和兩條輕鏈構成，含有4個功能區，無鉸鏈區。與IgG相比，IgY擺動性和柔韌性較低，結構更穩定，這可能與IgY分子重鏈和輕鏈之間有一個富含脯氨酸殘基和甘氨酸殘基的轉換區相關。IgY性能穩定，具有良好的熱穩定性，對酸堿有一定的耐受力，抗特定酶解尤其可抵抗幼年動物的胃酸屏障。Larsson等（1991）研究指出，IgY在65℃中活性可保持1 d以上，在4℃下貯存5年或室溫下貯存6個月抗體活性基本不下降；IgY在pH為4.0～11.0時最穩定，當pH高于11.0或低于4.0時活性才會降低。Yokoyama等（1993）研究發現，IgY能夠抵抗幼年動物胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。由于種屬差異性，禽類IgY與哺乳動物IgG之間不發生交叉血清學反應；IgY不與類風濕因子、葡萄球菌A蛋白、鏈球菌G蛋白和哺乳動物的Fc受體相結合，不激活哺乳動物的補體系統。

2 卵黃抗體制備影響因素

IgY制備效果受諸多變量共同影響，很難對單一因素的重要性做評估。禽的飼養情況、種屬、日齡、抗原劑量、佐劑、抗原的施用途徑和IgY的分離純化等均對卵黃抗體的效價有影響。

2.1 禽自身因素對卵黃抗體制備的影響 禽本身情況對IgY制備的影響主要表現在種屬、日齡等方面。Erhard等（2000）比較籠養和地面飼養的免疫雞特異性IgY濃度和平均IgY總濃度，結果發現，籠養雞的兩項指標均明顯高于地面飼養。制備IgY一般可使用商品蛋雞，也可用SPF雞。商品蛋雞與SPF雞相比，價格低且可在蛋雞開產前就進行免疫制備抗體，但應注意商品蛋雞的飼養環境，在健康良好的環境中飼養，才可減少因環境應激對IgY制備效果的影響。大量研究表明，用SPF雞制備的IgY含量較普通商品蛋雞高且制備的抗體更適用于治療某些疾病，但也有研究發現，SPF雞不僅對免疫原產生抗體，對佐劑也產生一些非特異性的抗體，故難以制備高純度的IgY。不同日齡的雞經免疫后IgY產生情況也不同，一般情況下，剛開產的青年蛋雞免疫效果最好。有研究分別對140、196、270日齡的海蘭褐蛋雞用膽囊收縮素（CCK）完全抗原免疫，結果發現，140日齡的雞產生抗體最快且效價最高 （臧海軍，2007；姚康，2005；丁雪梅，2003）。

2.2 免疫程序對卵黃抗體制備的影響

2.2.1 免疫劑量 抗原劑量的高低對免疫效果有一定的影響，不同抗原的最佳免疫劑量應該通過具體試驗獲得。Behn等（1996）研究表明，分別給每只雞注射0.1 mg和1.0 mg鼠IgG，結果發現，免疫劑量為0.l mg時獲得的免疫效果優于1.0 mg。同時研究發現，抗原劑量在10～l000 μg時獲得的免疫效果最好。王吉潭（2003）分別以0.5、1.0、1.5、2.0 mL/只免疫劑量胸肌多點免疫健康蛋雞，結果發現，以1.0 mL/只和1.5 mL/只的免疫劑量獲得的效果最好。王桂平等（2008）分別以低劑量（0.2 mg/只）和高劑量（0.4 mg/只）蝰蛇毒抗原初次胸肌免疫萊杭蛋雞，加免時劑量分別加倍，結果發現，高劑量組獲得的免疫效果比低劑量組好。杜洪橋等（2011）也得出相同結論，認為高劑量抗原免疫比低劑量免疫效果好。一般而言，抗原劑量在一定濃度范圍內，免疫效果隨抗原劑量的增加而加強，但抗原劑量過高容易引起動物免疫麻痹。

2.2.2 佐劑 佐劑是非特異性免疫增強劑，與抗原配合使用可增強機體對抗原的免疫應答。佐劑的類型和性質決定了免疫應答的程度和效果，選用適當的佐劑有助于產生高滴度的IgY。目前常用佐劑主要有無機鋁鹽佐劑、油性乳劑、脂多糖佐劑、脂質體佐劑、免疫刺激復合物佐劑、蜂膠佐劑和ASD佐劑系列等。甄宇紅等（2009）以滅活金黃色葡萄球菌為抗原，分別在商品弗氏佐劑和自制弗氏佐劑配合作用下免疫蛋雞，結果顯示，商品弗氏佐劑獲得了更好的免疫效果。賈莉等（2006）將豬致病性大腸桿菌菌液分別與弗氏佐劑、白油佐劑、氫氧化鋁、磷酸緩沖鹽溶液制成滅活疫苗免疫產蛋雞，結果發現，弗氏佐劑苗和白油佐劑苗較后兩者更能誘導產生穩定、高活性的IgY。大量研究表明，弗氏完全佐劑 （FCA）和弗氏不完全佐劑（FIA）仍是目前最有效的佐劑。FIA與FCA相比效力較低，但FCA易在注射部位發生局部組織反應，對動物組織造成損害。

2.2.3 注射途徑 制備IgY時常用注射途徑主要有肌肉注射、皮下注射、靜脈注射和法氏囊注射等。早期研究結果顯示采用皮下注射產生的抗體滴度比肌肉注射高，但目前大多數采用胸肌多點注射或胸肌和皮下聯合注射的方式。有研究發現，胸肌和頸部皮下多點聯合注射可獲得良好的免疫效果。江青東和王慧杰（2011）用牛乳鐵蛋白油乳苗免疫蛋雞，胸肌注射4個點，頸部皮下注射1個點，結果得到了高滴度的特異性IgY。靜脈注射操作難度較大，不易控制，注射時應緩慢小心避免并發癥。

2.2.4 免疫次數和間隔期 免疫次數影響IgY的效價和活性持續時間，不同抗原的具體免疫次數應綜合抗原類型、劑量以及佐劑等因素考慮。一般至少需要進行2次免疫，初次免疫抗原進入機體經過一段潛伏期后產生抗體，但效價低，活性持續時間短。加強免疫可促使體內產生高效價IgY，且活性持續時間長。研究表明，以人工制備的膽囊收縮素（CCK）完全抗原免疫蛋雞，前者免疫2次，而后者免疫4次，后者制備的IgY活性持續時間明顯長于前者（藏海軍，2007；姚康，2005）。免疫間隔期的長短對IgY的制備具有重要影響，免疫間隔時間太短會造成免疫耐受，免疫間隔時間太長不能產生高效價抗體。有學者推薦免疫間隔期以14 d或10 d為宜，但也有研究者發現，間隔7 d也可以取的好的免疫效果。一般初免后應間隔至少14 d再進行加強免疫，以便有足夠的時間產生“免疫記憶”，獲得更好的免疫效果。

2.3 分離純化對卵黃抗體制備的影響 根據 IgY不同的應用目的，采用的分離純化方法也應不同。IgY的應用目的一般可分為口服、注射、免疫學檢測等。如口服，可以將蛋黃直接冷凍或噴霧干燥制成卵黃粉飼喂動物。余冰和林曉斂（2009）在斷奶仔豬飼料中添加自制的CCK卵黃抗體粉飼喂仔豬。如需注射，則需要精制IgY。分離純化的IgY要去除脂類，避免病原微生物的垂直污染，如果卵黃中的脂類不能有效去除，將起到緩釋作用，易誘發機體對IgY產生免疫應答，而且脂類易發生腐敗變質，不利于保存。邵西兵（2005）將自制的抗瘦素卵黃抗體提純制成卵黃提取液，肌肉注射粵黃后備母雞。如將IgY應用于免疫學檢測，需要純度高，反應活性強，對分離提取的要求也更高。

3 特異性卵黃抗體在動物生產中的應用

3.1 防治動物疾病 因IgY具有耐酸堿、抗特定酶解和抵抗幼年動物的胃酸屏障等特性，故常在幼畜飼料中添加一定量的特異性IgY，以期獲得有效的被動免疫效果。致病性大腸桿菌是導致仔豬腹瀉的重要病原，近年來在斷奶仔豬基礎日糧中添加特異性IgY用于防治仔豬腹瀉的研究取得了一定進展。王吉潭（2003）選用72頭28日齡，平均體重為（8.5±0.1）kg 的斷奶仔豬（杜×長），公母各半，隨機分為4組，即對照組、普通全蛋粉組、抗K88、K99和987P高免全蛋粉組及血漿蛋白粉組，試驗分為兩個階段，第一階段分別飼喂上述4種試驗日糧，試驗時間為0～21 d，第二階段全飼喂對照組日糧，試驗時間為22～28 d，試驗全期內，抗K88、K99和987P高免全蛋粉組和血漿蛋白粉組仔豬未出現腹瀉現象，而對照組和普通全蛋粉組均有仔豬腹瀉，且抗K88、K99和987 P高免全蛋粉組斷奶仔豬平均日增重、飼料表觀消化率與對照組相比均顯著提高。許國棟（2009）將180 頭（24±2）日齡三元雜交（杜×長×大）斷奶仔豬，隨機分為3組，試驗持續28 d，0～14 d，在基礎日糧中分別添加3%噴霧干燥血漿蛋白粉、1.5%普通全蛋粉、1.5%由復后FaeG-FedF融合蛋白抗原免疫制備的高免全蛋粉；15～28 d，各組飼喂相同的日糧，結果發現，試驗全期內添加特異性高免全蛋粉組仔豬腹瀉率極顯著低于血漿蛋白粉組和普通全蛋粉組。鄭愛娟等（2005）在斷奶仔豬基礎日糧中分別添加0.1%和0.3%的抗大腸桿菌K88卵黃粉，結果發現，與飼喂基礎日糧的對照組相比，仔豬腹瀉率均能顯著減低。以上研究表明，特異性IgY對防治動物腹瀉具有顯著效果。特異性IgY經口服至腸道可附著在細菌的細胞膜上，阻止其與腸絨毛細胞上的菌毛受體結合，菌體無法黏附在腸道黏膜上而排出體外，最終導致腸道中致病性菌體減少或增殖減弱。Mahdavi等（2010）在感染大腸桿菌E.coli O78：K80的雛雞基礎日糧中分別添加0.1%、0.2%、0.4%抗E.coli O78：K80卵黃粉和0.2%、0.4%普通卵黃粉，結果發現，添加 0.2%、0.4%抗 E.coli O78：K80卵黃粉和0.4%普通卵黃粉對感染雛雞腸道中E.coli O78：K80的增殖具有明顯的抑制作用。說明特異性IgY對于防治致病性大腸桿菌具有現實可行性。

3.2 提高動物生長性能 大量研究表明，多種抗細菌或病毒的卵黃粉飼喂動物，對緩解動物病態，提高生產性能具有顯著效果。王建明等（2002）研究發現，斷奶仔豬基礎日糧中添加0.2%卵黃抗體添加劑可有效提高斷奶仔豬生長性能，試驗全期平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和飼料報酬與對照組相比都相應提高，尤其是第一周效果最明顯，平均日增重、平均耗料量和飼料報酬較對照組分別提高了76.8%、14.5%和35.1%。王吉譚（2003）用含有抗K88+、K99和987 P的卵黃粉飼喂斷奶仔豬，飼喂2周后發現斷奶仔豬ADFI、ADG和飼料轉化率（F/G）均顯著提高，效果與血漿蛋白組相似。朱錦蘭等（2004）將120只平均體重58.37 g的1日齡仙湖3號健康雛鴨，隨機分為對照組和試驗組，試驗組日糧在對照組日糧基礎上添加0.1%含有K88、K99、987 p大腸桿菌特異性卵黃抗體，結果發現，8～49日齡試驗組ADG顯著高于對照組，8～14日齡F/G顯著高于對照組。李肖梁等（2006）將900只120日齡健康中華鱉隨機分為3組，雌雄各半，對照組飼養基礎日糧，試驗組分別在基礎日糧中添加2‰自制抗嗜水氣單胞菌IgY和2‰自制無特異性IgY，試驗過程中發現飼料中添加抗嗜水氣單胞菌IgY試驗組與對照組相比ADG極顯著提高，平均攝食時間極顯著縮短。以上研究表明，利用特異性IgY可緩解動物病態，提高動物生產性能。CCK是一種參與中樞和外周攝食調控的飽食因子，抑制胃酸分泌，降低采食量。研究發現，在動物飼料中添加抗CCK卵黃粉可提高采食量和生產性能。張曉萍（2004）在 SD大鼠飼料中分別添加 0、70、150、300mg／kg抗CCK卵黃粉，發現添加70 mg／kg抗CCK卵黃粉組SD大鼠在51～58日齡采食量顯著高于對照組。臧海軍（2007）研究發現，在1日齡艾維因雛雞基礎飼糧中添加80 mg／kgCCK卵黃抗體粉，其22～42日齡采食量比基礎飼糧組提高1.18%。姚康（2005）研究報道，在經產母豬的基礎飼糧中添加1.2%抗CCK卵黃粉，可使整個泌乳期母豬采食量提高3.8%。余冰和林曉斂（2009）在斷奶仔豬基礎日糧中分別添加 0、100、200、300、400 mg/kg抗CCK卵黃粉。試驗全期內，ADG和ADFI均隨CCK卵黃抗體粉添加水平的增加而呈二次曲線提高，且添加200 mg/kg抗CCK卵黃粉試驗組效果最好，與對照組相比仔豬血清中CCK濃度下降，ADG提高12.14%，ADFI提高6.92%。某些動物因脂肪過多而口感不佳，有研究者利用脂肪細胞膜蛋白免疫蛋雞制備特異性IgY添加到飼料中飼喂動物，降低其脂肪沉積。姜錦鵬（2006）在 27 kg左右杜×（長×梅）三元雜交商品豬基礎日糧中添加75 mg/kg抗脂肪組織細胞膜蛋白卵黃粉，對照組添加75 mg/kg陰性卵黃粉，結果發現，試驗組豬與對照組相比ADG提高13.03%，瘦肉率提高10.3%，背膘厚下降24.14%，并可改善肉色。提示，在育肥豬日糧中添加抗脂肪組織細胞膜蛋白卵黃粉可促進豬生長，提高瘦肉率，降低脂肪。周杰等（2011）研究也得到相似結論。

4 小結

卵黃抗體可作為抗生素替代品，防治畜禽疾病，提高生產性能，且不存在藥物殘留和耐藥性問題。但目前對影響卵黃抗體制備的多種因素間的相關性還缺乏系統的研究，適合工業化生產且成本低、效價高、符合質量標準的方法仍是今后研究的重點。

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