高效液相色譜法測定雞飼料中噁喹酸的含量

中國農業大學動物醫學院 吳 超 程林麗 張素霞 董曉云

北京市順義區動物衛生監督所 李林霞

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 高效液相色譜儀Waters 2996-Photodiode Array Detector（Waters 2695 Separations Module）；配熒光檢測器；渦動儀（北京北德科學器材有限公司）；2K15通用臺式冷凍離心機（美國 Sigma公司）；R-200旋轉蒸發儀 （瑞士BUCHI公司）；天平（感量 0.01 g，德國 Accula 公司）；分析天平（感量 0.0001 g，德國 Sartorius公司）；水平搖床；移液器；一次性注射器；0.45 μm有機濾膜。

1.2 藥品和試劑 除特殊注明外，本法所用試劑均為分析純，水符合GB/T 6682中一級水的規定。喹酸標準品 （純度 ≥99.7%，購于Sigma公司）；甲醇、乙腈均為色譜純（購于Sigma公司）；氫氧化鈉；無水硫酸鈉；乙酸乙酯；正己烷；磷酸。

1.3 標準溶液的配制

1.4 液相色譜條件 色譜柱：Intel ODS-3 C18柱，50 mm×4.6 mm（i.d.），粒徑 5 μm；柱溫：室溫；流動相：0.02 mol/L磷酸溶液－乙腈－四氫呋喃（69∶16∶15，V∶V∶V）；流速：0.8 mL/min；進樣體積：20 μL；激發波長：325 nm；發射波長：369 nm。

1.5 樣品前處理 稱取配合飼料2 g（或濃縮飼料、預混合飼料1 g，精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加無水硫酸鈉2 g，加乙酸乙酯10 mL，300 r/min振蕩30 min。經8000 r/min離心10 min后，取上清液至雞心瓶。殘渣中加入10 mL乙酸乙酯，重復提取一次，合并兩次上清液。50℃旋蒸至干，加入0.02 mol/L磷酸溶液0.8 mL，渦動10 s，再加入正已烷1.6 mL，渦動1 min。將混合液轉入10 mL離心管中，于3000 r/min離心10 min，取下層清液并用0.02 mol/L磷酸溶液定容至1.0 mL，過0.45 μm有機濾膜后供高效液相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制 用流動相稀釋呵惡喹酸標準貯備液， 配制成濃度為 10、20、50、100、300、500 ng/mL的系列工作液，以藥物濃度為橫坐標，喹酸峰面積為縱坐標繪制標準曲線（圖1）。喹酸的標準曲線方程為y=53.83x-139.6，相關系數為0.999。

2.2 方法的靈敏度 取10個空白樣品按1.5中的方法處理后進行HPLC檢測。測得基線噪音值，并求其平均值。按信噪比S/N=3為檢測限（LOD），S/N=10為定量限（LOQ），結果見表1。由表1可見，雞配合飼料、雞濃縮飼料、雞預混合飼料中喹酸檢測限為 2.02～5.93 μg/kg，定量限為 6.72～19.74 μg/kg。因此，確定方法的檢測限為 6.0 μg/kg，定量限為 20.0 μg/kg。

2.3 檢測方法的準確度和精密度 對雞配合飼料、雞濃縮飼料、雞預混飼料分別進行20、200、2000 μg/kg的藥物空白添加回收實驗，按1.5中的方法處理后進行HPLC檢測。每個濃度設5個平行，連續做3 d，計算添加回收率、日內變異系數和日間變異系數，結果見表2。由表2可見，在三個濃度添加水平下，各類飼料中喹酸的平均回收率為85.75%～96.77%，均滿足70%～120%；日內變異系數為2.24%～9.63%，均小于15%，日間變異系數為2.35%～8.35%，均小于15%，方法回收率高，精密度好。各類飼料的相關色譜圖見圖2至圖8。由圖可見，在雞配合飼料、雞濃縮飼料、雞預混飼料中喹酸保留時間處無雜峰干擾。

表1 飼料中喹酸檢測的LOD和LOQ（n=10） μg/kg

表1 飼料中喹酸檢測的LOD和LOQ（n=10） μg/kg

飼料種類 LOD LOQ雞配合飼料 4.60 15.32雞濃縮飼料 4.14 13.80雞預混合飼料 2.02 6.72

表2 飼料中喹酸添加回收率及變異系數

表2 飼料中喹酸添加回收率及變異系數

樣品 添加濃度/（μg/kg）平均回收率/% 日內變異系數（n=5，%）日間變異系數（n=15，%）雞配合飼料20 93.16 6.46 6.82200 92.43 5.28 6.752000 94.62 7.75 8.1710000 87.33 5.29 6.31雞濃縮飼料20 92.73 6.82 7.14400 92.96 7.10 7.284000 94.55 5.79 6.22100000 85.75 2.24 2.35預混合飼料20 96.77 4.86 5.62200 90.56 9.63 8.3510000 94.64 7.39 7.74100000 88.95 5.06 5.18雞

3 討論

3.1 儀器條件的建立 劉艷萍等（2009）用0.01 mol/L 草酸-乙腈（65∶35，V∶V）分析了鰻魚中的喹酸。李耀平等（2004）采用乙腈-水（用冰乙酸調pH3.0，60∶40，V∶V∶V） 分析了出口歐鰻中的喹酸。仲鋒等（2002）以及農業部236號公告中均采用0.02 moL/L磷酸溶液-乙腈-四氫呋喃 （69∶16∶15，V∶V∶V）分離檢測了魚肉組織或動物樣品組織中的喹酸和氟甲喹。錢疆等（2002）年用甲醇-乙腈-5 mmol磷酸二氫鈉 （用20%磷酸調pH=3）分析出口水產品中的喹酸。通過對上述文獻報道的儀器分析方法進行驗證，結果發現，這些流動相條件均能滿足喹酸的檢測需要，但采用0.02 mol/L 磷酸溶液-乙腈-四氫呋喃 （69∶16∶15，V∶V∶V）流動相分析時喹酸峰形最佳，出峰時間最合適，因此采用該流動相組成。

3.2 樣品前處理 在樣品的提取凈化中，分別采用乙酸乙酯、磷酸鹽緩沖液、乙腈試劑進行研究，結果表明，乙酯乙酯提取的藥物回收率在95%以上且共提取物較少；磷酸鹽緩沖液提取，共提取雜質多且去蛋白不徹底；乙腈提取共提取物雖少，但回收率僅70%左右。因此選擇乙酸乙酯作為樣品提取液。用乙酯乙酯提取飼料中的喹酸后，通過旋轉蒸發和磷酸緩沖液復溶來轉換溶劑，然后經正已烷去脂凈化后分析。整個樣品前處理過程未使用價格昂貴的固相萃取小柱，節省了分析成本，且整個提取過程步驟簡單，易于操作。

4 結論

[1]劉艷萍，冷凱良，王清印，等.高效液相色譜法測定鰻魚中氟甲喹和喹酸的殘留量[J].上海海洋大學學報，2009，18（3）：332 ～ 337.

[2]李耀平，李壽崧，吳文忠，等.出口歐鰻中喹酸殘留痕量檢測新技術研究[J].檢驗檢疫科學，2004，14（2）：37 ～ 39.

[3]錢疆，李耀平，李壽崧.出口養殖水產品喹酸殘留的HPLC監控、驗證檢測[J].福建分析測試，2002，11（3）：1606 ～ 1609.

[5]Harry V B.Analysis of oxolinic acid in fish by high—performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography，1990，530：75 ～ 82.