應用PCR-DGGE分析肉雞呼吸道中細菌多樣性

山東寶來利來生物工程股份有限公司 汪孟娟 曹銀生 胡艷霞 王京京 辛國芹 徐海燕

動物呼吸道疾病易造成動物生長減緩、料肉比增高、產蛋力降低、免疫力下降，更有甚者直接導致動物死亡或者繼發其他疾病死亡，給養殖戶帶來巨大的損失。然而使用抗生素治療該病又會帶來一系列副作用，因此開發一種通過恢復和調整動物呼吸道內菌群平衡，達到預防和治療動物呼吸道感染的微生態制劑十分必要。Sullivan等（2001）認為，正常的微生物菌群可以起到防止潛在的致病微生物建群及防止己經存在的機會菌過度生長的作用。由此看來，研究呼吸道正常菌群的演替次序和變化特征，是深入認識炎癥本質、開發呼吸道益生菌的理論依據。

1993年Muzyer等首次將變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術應用于微生物生態學研究，并證實該技術在研究自然界微生物群落遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優越性。本試驗通過PCR-DGGE技術分析了肉雞呼吸道細菌菌群結構，并對優勢菌進行了鑒定，探討此方法在研究動物呼吸道微生物多樣性的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集與處理 分別取 10、20、30、40日齡的肉雞（采自泰安某肉雞養殖場），于超凈臺下分別取喉管和氣管，剪碎放入無菌離心管中。

1.1.2 主要儀器 PCR儀、DGGE電泳儀（Bio-Rad）。

1.2 總DNA的提取 向裝有喉管和氣管的離心管中，分別加入5 mL無菌生理鹽水，振蕩5 min，800 r/min離心10 min，取上清于無菌1.5 mL EP管中，12000 r/min，離心 2 min，倒掉上清。DNA提取采用Mobile公司的BIO-101 DNA extraction Kit試劑盒，步驟按說明書進行。

1.3 16 S rDNA V3片段的PCR擴增 將提取的DNA直接作為PCR模板，采用對大多數細菌的16 S rRNA基因V3區具有特異性的引物對（錢麗君，2007）：341F（5’CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA- CGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 534R（5’-ATTAC-CGCGGCTGCTGG-3’）， 擴增長約 200 bp， 用于DGGE 分析。 PCR 反應體系 （25 μL）：2×Taq mix 12.5 μL，上下游引物（25 pmol/μL）各 1 μL，模板DNA 1 μL，無菌雙蒸水 9.5 μL。PCR 反應條件：采用降落 PCR，94℃預變性 4 min；94℃ 1 min，65℃45 s，退火溫度每個循環降低0.5℃，當退火溫度降至55℃后，再以該溫度擴增15個循環；最后72℃延伸8 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE） DGGE變性梯度凝膠濃度為8%，變性梯度為30%～70%（7 mol／L尿素和40%甲酰胺為100%變性）。電泳時，首先在220 V電壓下預電泳10 min，隨后在85 V的固定電壓下電泳16 h。電泳結束后，進行硝酸銀染色（Bruck等，2003），用數碼相機對結果拍照，并采用 Quantity One軟件 （Bio-Rad）對DGGE圖譜進行聚類分析。

1.5 DGGE圖譜中部分優勢條帶的序列分析用無菌手術刀將DGGE圖譜中部分分離明顯、條帶清晰且亮度高的優勢性條帶從凝膠上切下，加入40 μL去離子無菌水，將膠塊搗碎，4℃過夜。取液體做模板進行PCR擴增，引物為去掉“GC夾”的 341 F和 534 R，PCR體系和條件同上（Devillard等，2005）。擴增產物送上海生工生物工程技術有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 16S rDNA片段的擴增 16S rDNA PCR產物瓊脂糖電泳結果見圖1。由圖1可見，通用引物341 F及534 R對各樣品細菌16 S rRNA基因均得到較好擴增。

2.2 DGGE指紋圖譜及圖譜分析結果 各樣品DGGE指紋圖譜見圖2。由圖2可見，不同部位比較，肉雞的喉和氣管中細菌的DGGE圖譜的條帶數、條帶位置和亮度存在一定程度的差異，但總體來說，雖然樣品條帶數較多，但優勢條帶變化不大，條帶A、B、C、D、E和F在整個養殖周期的喉和氣管中一直保持優勢地位，經鑒定分別為：Citrobacter sp.，Pseudomonas aeruqinosa，Pasteurellaceae bacterium，Uncultured bacterium，Gallibacterium anatis，Uncultured Enterobacteriaceae bacterium。G條帶只在肉雞養殖后期的喉中占優勢，鑒定為：Mycoplasma qallisepticum。

相同部位不同日齡樣品比較，養殖中、后期喉的樣品條帶數明顯多于養殖前期，其中條帶H和I在養殖中期出現后，便一直存在于整個養殖過程，并保持一定的亮度，經鑒定為Klebsiella pneumoniae和 Uncultured bacterium，條帶 J雖然在養殖前期的喉管樣品中已被檢測到，但亮度較暗，在養殖中期的樣品中開始變亮，經鑒定為Klebsiella pneumoniae；對于氣管樣品來說，30日齡左右肉雞的氣管樣品條帶數明顯多于其他時期。

UPGMA相似性聚類結果表明，養殖前期樣品喉中的條帶與養殖中后期相似度較低，只有55%；養殖中、后期不同部位，同一時期的樣品相似度均達到了75%，說明在整個養殖過程中，肉雞呼吸道中細菌菌群結構是在發生變化的。

3 討論

DGGE技術主要是利用梯度變性膠來分離DNA片段，理論上認為，只要選擇的電泳條件，如變性劑梯度、電泳時間、電壓等足夠精細，有一個堿基差異的DNA片段均可被分開。DGGE具有傳統微生物分析方法無可比擬的優勢，在科學研究中廣泛應用（Ferguson，2007）。

在本研究中，16S rDNA V3區的PCR-DGGE圖譜能夠很好地對肉雞呼吸道中的細菌進行區分，雖然數據不能代表所有肉雞呼吸道內細菌群落的情況，但可以說明PCR-DGGE技術能夠有效地用于呼吸道菌群的分析。其DGGE圖譜可以反映菌群的組成情況，同時結合圖譜中條帶的序列分析，還可以了解具體的優勢菌群的種類。

在畜禽養殖中，應用PCR-DGGE技術可建立一種不依賴傳統分離培養技術而能原位揭示畜禽體內細菌種群組成的分子診斷技術和病原菌分子診斷技術。通過檢測畜禽呼吸道正常微生物區系組成，建立基于機體內優勢菌群結構的健康畜禽動物評價技術，還可檢測畜禽動物呼吸道微生物的動態變化和病害后微生物區系組成的差異，以及使用微生態制劑前后微生物區系組成的差異。通過對畜禽呼吸道內細菌種群結構的揭示，為新的畜禽微生物制劑菌株的開發和應用提供候選菌株和理論基礎。

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