基于石蠟包埋組織熒光原位雜交的技術(shù)問題

陳瓊霞鎮(zhèn)鴻燕李 艷劉麗江*

（1 江漢大學(xué)病理診斷所 病理技術(shù)部，湖北 武漢 430056；2 江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，湖北 武漢 430056）

基于石蠟包埋組織熒光原位雜交的技術(shù)問題

陳瓊霞1鎮(zhèn)鴻燕2李 艷1劉麗江2*

（1 江漢大學(xué)病理診斷所 病理技術(shù)部，湖北 武漢 430056；2 江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，湖北 武漢 430056）

石蠟包埋組織；熒光原位雜交技術(shù)；問題

熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)是一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，利用核酸探針雜交原理，通過熒光標(biāo)記的DNA 探針與細(xì)胞核內(nèi)的待檢測(cè)的DNA靶序列結(jié)合，在熒光顯微鏡下顯示出 DNA 靶序列的雜交信號(hào)的一種技術(shù)。FISH技術(shù)與傳統(tǒng)的放射性核素標(biāo)記的原位雜交相比，具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高、可進(jìn)行多重染色以及無放射性污染等優(yōu)點(diǎn)。目前，F(xiàn)ISH技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于不同的學(xué)科領(lǐng)域，如動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體結(jié)構(gòu)變異的分析、人類疾病的診斷及發(fā)病機(jī)制的研究等。

近年，將FISH技術(shù)用于石蠟包埋的人體組織中進(jìn)行疾病的診斷已經(jīng)有了非常大的進(jìn)展，成為臨床病理診斷工作中重要的分子生物學(xué)技術(shù)手段之一，尤其是在乳腺癌的分子靶向的治療標(biāo)志物HER-2的檢測(cè)、淋巴瘤及軟組織腫瘤的分子診斷及靶向的治療中發(fā)揮極為重要的作用[1]。我們?cè)谂R床實(shí)踐中，探索了石蠟包埋組織中FISH技術(shù)的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了一些需要注意的技術(shù)問題等，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 組織的固定是基礎(chǔ)

病理科保存的人體組織，首先要經(jīng)過福爾馬林的固定。組織固定的質(zhì)量水平已嚴(yán)重影響著各種先進(jìn)技術(shù)尤其是分子生物學(xué)技術(shù)在臨床病理學(xué)中的應(yīng)用。常規(guī)的組織固定液是指10%的中性福爾馬林，濃度的過高過低，固定液的pH值過高過低均影響組織的固定質(zhì)量。福爾馬林可以使DNA或蛋白質(zhì)的氨基團(tuán)間形成亞甲基網(wǎng)橋，以利于維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和組織的形態(tài)，同時(shí)也可以保證DNA不發(fā)生降解和斷裂，使后續(xù)的各種檢測(cè)技術(shù)得以進(jìn)行。所以，有效的組織固定是非常關(guān)鍵的。此外，固定的時(shí)間同樣重要，固定時(shí)間不足以及固定時(shí)間過長(zhǎng)也將影響組織固定的質(zhì)量。我們?cè)谂R床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，pH值為7.2的10%的福爾馬林固定液將組織固定24h是最為理想的。離體組織的及時(shí)固定、大塊組織的切開固定也是保證組織固定質(zhì)量的重要條件。然而，在日常的工作中這些因素又是最容易被忽視的，也是執(zhí)行的不夠好的。因此，我們認(rèn)為要提高石蠟包埋切片F(xiàn)ISH的質(zhì)量，組織固定是最重要的基礎(chǔ)。

2 石蠟切片的消化是關(guān)鍵

石蠟切片的FISH操作過程中，對(duì)于切片的前處理以及處理的效果好壞是獲得良好雜交信號(hào)的前提。如果處理不夠或處理過度都將直接影響雜交的結(jié)果，導(dǎo)致探針無法與DNA靶序列結(jié)合。因?yàn)?，在組織固定時(shí)，福爾馬林液使DNA及蛋白質(zhì)間形成的亞甲基網(wǎng)橋，阻礙了核酸探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使得雜交信號(hào)減弱或不能獲得雜交信號(hào)。

酶消化處理是最常用的前處理方法，也是最為關(guān)鍵及最難把握的環(huán)節(jié)，操作者需要積累經(jīng)驗(yàn)，尤其是對(duì)不同的組織、不同的待測(cè)靶序列的雜交，要采用不同的處理方法。常用于石蠟切片F(xiàn)ISH的消化酶有胃蛋白酶和蛋白酶K，根據(jù)組織切片的厚度和酶的濃度，消化過程一般需要10～30 min的時(shí)間[2]。有文獻(xiàn)報(bào)告胃蛋白酶對(duì)石蠟包埋切片的消化能力比較差，而且所需時(shí)間也比較長(zhǎng)，雜交后效果不夠理想[3]。蛋白酶K具有很強(qiáng)的活性，配制后不容易很快發(fā)生變性，是理想的FISH前處理消化酶。由于蛋白酶K的消化效率比較高，如果濃度過高、消化時(shí)間過長(zhǎng)或孵育溫度過高都會(huì)導(dǎo)致消化過度，對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞，細(xì)胞核變得模糊不清。同時(shí)，組織切片也容易發(fā)生脫落，影響雜交結(jié)果。我們的經(jīng)驗(yàn)是，對(duì)于組織結(jié)構(gòu)多樣又含有比較豐富的結(jié)締組織的樣本，如乳腺浸潤(rùn)性癌等，采用蛋白酶K的消化要優(yōu)于胃蛋白酶。而對(duì)于組織結(jié)構(gòu)比較單一，細(xì)胞密度比較大的組織，如淋巴瘤、軟組織肉瘤等，胃蛋白酶的消化要優(yōu)于蛋白酶K。

酶促反應(yīng)的條件與三個(gè)因素有關(guān)，即濃度、溫度和時(shí)間。因此，酶消化的時(shí)間和溫度也是非常重要的環(huán)節(jié)，不論選擇哪種消化酶，消化處理的時(shí)間不易超過30min，特別是使用胃蛋白酶消化時(shí)，時(shí)間最好控制在20min以內(nèi)。因?yàn)椋傅鞍酌溉菀资Щ睢Ｎ覀兘梃b了其他單位的經(jīng)驗(yàn)，采用20 g/L的蛋白酶K在50度的溫度下消化20min的方法，取得了比較好的效果。

3 雜交的條件與時(shí)間是可變的

樣本的前處理完成之后，依次進(jìn)行FISH的各個(gè)步驟，包括：固定、變性、雜交、沖洗、復(fù)染及封片等環(huán)節(jié)。變性的條件是可以根據(jù)組織切片的特點(diǎn)及待測(cè)靶序列的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。雜交的溫度一般都選擇37℃，但是雜交的時(shí)間也是可以根據(jù)上述的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。簡(jiǎn)言之，不同的實(shí)驗(yàn)室需要選擇一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的雜交效果好的條件和時(shí)間，并確定下來，以保證石蠟切片F(xiàn)ISH的質(zhì)量控制。

綜上所述，基于石蠟切片的FISH技術(shù)的建立，使FISH技術(shù)很快的從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用中。建立和完善石蠟包埋組織的FISH質(zhì)量控制，將有助于該項(xiàng)技術(shù)在臨床的進(jìn)一步推廣與應(yīng)用。正確的組織固定、合理的石蠟切片的消化以及可調(diào)整的雜交條件和時(shí)間，均將保證高質(zhì)量的FISH檢測(cè)結(jié)果的獲得。

[1] NaKayama R,Miura Y,Ogino J,et al.Detection of HEY1-NCOA2 fusion by fluorescence in-situ hybridization in formalin-fixed paraffin-embedded tissues as a possible diagnostic tool for mesenchymal chondrosarcoma[J].Pathol Int.,2012,62(12)∶823-826.

[2] Paternoster SF,Brockman SR,McClure RF,et al.A new method to extract nuclei from paraffin-embedded tissue to study lymphomas using interphase fluorescence in situ hybridization[J].Am J Pathol, 2002,160(6)∶1967-1972.

[3] 王靜,章鈞,張宏,等.FISH檢測(cè)石蠟包埋組織切片的理想消化時(shí)間[J].廣東醫(yī)學(xué),2010,31(5)∶555-557.

R329.2+3

A

1671-8194（2013）13-0382-01

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