乳腺癌高表達基因CKAP2L的生物信息學分析*

許亞娜，許 倩，劉 鐳△

(1.承德市婦幼保健院，河北承德 067000;2.承德醫學院)

乳腺癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤，篩查腫瘤生物標記物對早期診斷具有重要意義[1]。本研究通過腫瘤基因組解剖計劃(CGAP)SAGE數據庫，篩選新的乳腺癌高表達基因，并對其中一條功能未知的新基因CKAP2L進行了初步的生物學分析，為進一步深入研究該基因的生物學功能及其參與乳腺癌發生、發展的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 收集承德醫學院附屬醫院腫瘤科5例乳腺癌組織及對應的癌旁組織(距癌灶邊緣＞2cm)，同期5例乳腺纖維瘤組織。

1.2 差異基因的篩選 利用CGAP提供的SAGE Genie數據庫，選取數字基因表達演示工具。選擇乳腺癌組織和乳腺正常組織兩個池，設置F值為16，Q為0.1。

1.3 序列比對 利用BLAST軟件檢索EST數據庫、nr數據庫及pro數據庫，將所克隆的基因核苷酸序列與GeneBank中已知核苷酸序列進行同源性分析。氨基酸序列相似性分析用NCBI/blastp,多序列比對和進化樹分析用clustal W。

1.4 理化性質和亞細胞定位 對蛋白質分子量、等電點、疏水性等理化性質分析用ExPASy-protparam Tool，采用PSORT II server進行亞細胞定位的預測。

1.5 蛋白質結構預測 ELM預測蛋白質功能性位點[2]。信號肽及剪切位點預測用SignalIP，二級結構預測應用SOPMA工具，保守結構域用NCBI/CDD預測。

1.6 電子表達譜分析 通過美國國家生物技術信息中心UniGene庫中的EST表達情況分析，獲得CKAP2L基因電子表達譜。

1.7 半定量RT-PCR驗證性實驗 TRIZOL法提取總RNA，按逆轉錄試劑盒(QIAGEN)操作步驟進行逆轉錄。PCR反應體系25μl，其中包括2.5μl cDNA 模板，2.5μl 10×PCR反應緩沖液，0.5μl dNTP(10mM)，0.5μl Taq DNA 聚合酶，上下游引物各0.5μl。CKAP2L 上游引物為5’-TGGTCCAATCCCTAGAAT-3’，下游引物為5’-CCTGAGCGTCCATAATCT-3’。反應條件為94℃ 15s、61℃ 30s、72℃ 40s，30 個循環。以GAPDH 作為反應內參，取10μl PCR產物，在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

2 結果

2.1 乳腺癌高表達基因的篩選 篩選出28個在乳腺癌中高表達的基因，并從中選取一條功能未知的明顯高表達基因CKAP2L。38個短序列標簽文庫中，18個具有CKAP2L代表標簽(GGAAAATCTT)，出現1265次。25個正常乳腺中，有兩個文庫，表達差異為6.41倍。同時，23個長序列標簽文庫中，17個具有CKAP2L代表標簽(TTGTAAATCTTAAATAT)，出現881次。而18個正常組織只有一個出現該標簽，差異為3.57倍。因此，該基因具有在乳腺癌組織中高表達的趨勢。

2.2 CKAP2L在GeneBank中的序列比對結果 共有41條序列與CKAP2L高度同源，其中發現一條序列是CKAP2L的轉錄變異體，GeneBank登陸號為BC036217.1。經對CKAP2L的多物種氨基酸序列相似性比較，人與大猩猩、家貓、小鼠的相似性分別為75%、62%、62%，氨基酸組成在脊椎動物中保守性較高。各物種序列大小接近，起始氨基酸都是蛋氨酸。

2.3 理化性質與亞細胞定位 CKAP2L(NM_152515)由745個氨基酸組成，相對分子量為83586.6，等電點為9.84。該蛋白的半衰期在哺乳動物網織紅細胞中為30h;不穩定指數為52.76，為不穩定蛋白;脂肪指數為74.04，平均親水系數為-0.829，預測為疏水蛋白。根據軟件分析，預測該蛋白在細胞核中表達的可能性最大(65.2%)，其次是細胞骨架(17.4%)和高爾基體(8.7%)。

2.4 蛋白質結構 預測發現有CK1、CK2、PIKK、PKA等磷酸化位點，MAPK作用識別位點，FHA等結合基序，尤其是具有一個磷酸化基序，能直接與乳腺癌基因BRCA1的BRCT結構域低親和性結合。未預測出信號肽剪切位點。預測二級預測發現α螺旋占48.5%，β折疊占7.01%，延伸鏈和無規則卷曲結構分別占9.99%和34.5%。

2.5 CKAP2L基因表達 電子表達譜分析顯示，CKAP2L基因在部分正常組織和多種腫瘤中均有表達(見附表)。

附表 CKAP2L基因電子表達譜

2.6 CKAP2L在乳腺癌組織和乳腺纖維瘤中的表達 RTPCR結果顯示，CKAP2L在5例乳腺癌組織中，3例高表達，而在相應的癌旁組織和5例乳腺纖維瘤中均不表達。

3 討論

發現乳腺癌高表達基因對研究乳腺癌的發生機制，提高腫瘤分期的準確性，預測腫瘤的轉移與否和預后判斷有重要意義[3]。基因表達系列分析(SAGE)可用于全面分析腫瘤組織基因表達譜，尋找腫瘤特異性表達新基因，發現腫瘤組織特異標志物和揭示腫瘤發病的分子機制[4]。我們應用該文庫，比較乳腺癌和正常乳腺組織的差異表達，篩選出乳腺癌高表達基因CKAP2L。而且，半定量RT-PCR結果也證實了生物信息學數據庫的可靠性。該基因在多例乳腺癌組織中高表達，而在癌旁和其它乳腺良性腫瘤中均無表達。

目前，尚無對CKAP2L功能的研究。ELM分析提示，該蛋白具有CK1、CK2、PIKK、PKA等磷酸化位點，MAPK作用識別位點，FHA等結合基序，半胱天冬酶3和7酶切位點。PIK和PKA磷酸化位點是信號傳導調控中的常見分子結構，在細胞增殖及細胞周期中有著廣泛的調節作用[5]。半胱天冬酶-3和-7的蛋白酶在細胞凋亡中發揮重要的作用，半胱天冬酶底物酶切導致凋亡細胞的特征性形態學改變。BRCT結構域是主要存在于真核生物的蛋白組件。尤其重要的是，CKAP2L中具有一個與乳腺癌基因BRCA1的BRCT結構域低親和性結合的磷酸化基序，BRCT結構域出現于與DNA損傷反應相關的蛋白中，它們識別并結合特定的磷酸化絲氨酸序列。這種BRCT結構域的磷酸化蛋白質介導的泛素化作用，在細胞周期檢查點和DNA修復功能中發揮著核心作用。這點也提示，CKAP2L可能通過與BRCA1相互作用而參與乳腺癌的發生、發展過程[6]。

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