正電子心肌灌注顯像劑18F-TPT的合成及生物學分布

張曉軍, 劉 健, 關志偉，田嘉禾，孫志軍，張錦明

(中國人民解放軍總醫院 核醫學科，北京 100853)

冠心病(CAD)是由于冠狀動脈異常造成心肌供血不足、心肌氧供需失衡引起的心臟病變，也稱缺血性心臟病。核醫學技術診斷CAD，具有多種特定生物活性的示蹤劑，可以從不同角度反映心血管的生理、生化信息，可以在活體顯示上述示蹤劑的動力學，并且具有較高的靈敏度和可重復性。心肌灌注顯像通常用來診斷心肌疾病和了解心肌供血情況，放射性核素201Tl[1]和99Tcm[2]標記化合物是常用的SPECT心肌灌注顯像劑，但由于SPECT顯像的固有特性、光子的衰減以及锝藥物在心臟毗鄰器官的彌散性攝取而影響心肌對示蹤劑攝取的精確定量。PET相對SPECT在時間和空間上有更好的分辨率，并且可以建立標準有效的衰減校正方法。15O-H2O[3]、13N-NH3[4]、82Rb-RbCl[5]都是常用的PET心肌灌注顯像劑，但15O、13N、82Rb的半衰期分別只有2 min、9.96 min和76 s，其在臨床上應用受到很大局限。18F標記的心肌灌注顯像劑成為近年來研究熱點，其半衰期為110 min，較適用于臨床。18F標記的心肌灌注顯像劑從心肌攝取機制上主要分兩種：親脂性陽離子通過跨膜被動擴散進入線粒體而在心肌富集；MC-Ⅰ抑制劑衍生物通過與線粒體中的MC-Ⅰ復合體結合聚集在心肌[6]。18F標記的親脂陽離子又分為季鏻鹽和季銨鹽，二者進入心肌的機制是一致的。季銨鹽類化合物如18F-FTMA[7]，其在動物體內穩定性較差，而且肝臟的攝取較高，注射20 min后心與肝放射性攝取比為0.8，肝臟攝取對圖像質量造成影響。季鏻鹽類化合物如18F-FBnTP[8]和18F-FETMP[9]，該類藥物心肌攝取高滯留時間長，沒有再分布性質，可以對狹窄的嚴重程度進行定量，心肌缺血部位放射性缺失明顯，肝、肺等非靶器官清除較快，但標記方法復雜，合成時間長，放化產率較低等因素制約了其應用。MC-Ⅰ的抑制劑如噠螨靈、蝰螨醚、色酮等，攝取機制與血流流量密切相關，目前已有18F標記的噠螨靈衍生物18F-BMS-747158-02[10]進入三期臨床，該化合物在小鼠心肌有一定攝取和較好保留，肝和肺的本底低，永久缺血或暫時缺血的大鼠模型心肌顯像顯示，缺血心肌的大小與放射性缺失部分大小成線性相關，該藥物也可以檢測慢性缺血，心肌攝取與血流流速線性相關。此外，牟甜甜等[11]利用聚乙二醇修飾噠螨靈，標記得到18F-FP1OP、18F-FP2OP和18F-FP3OP心肌顯像藥物，該系列化合物心肌攝取快，肝本底低，心肌顯像中不僅能指示缺血部位，還可以區分缺血的不同程度，具有較大的臨床應用潛力，但其在水溶液和小鼠血清中不穩定，需進一步修飾結構來提高穩定性。本研究擬采用18F標記新型心肌灌注顯像劑4-氟苯基-三苯基磷 (TPT)得到18F-TPT，并研究其在小鼠體內生物分布以及大鼠Micro-PET/CT顯像。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

Sumitomo HM-20S 回旋加速器：日本Sumitomo公司；PET-MF-2V-IT-I型氟多功能合成模塊：北京派特生物技術有限公司；PTS(內毒素快速檢測儀)：美國charles river公司；HPLC分析儀：配515泵，2487紫外檢測器，分析柱Phenomenex Gemini 5 μm，100 A，C18 (4.6 mm×150 mm)，BioScan流動放射性檢測器，美國WATERS公司；Explore VISTA Micro-PET/CT：美國GE公司。

1.2 主要試劑

豐度98 % H218O：常熟華益化工有限公司；無水乙腈：美國Sigma-Aldrich公司；無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；氨水：北京化工廠；磷酸：北京紅星化工廠；前體(4-硝基苯基)三苯基磷硝酸鹽、標準品 (4-[19F]氟苯基)三苯基磷：美國Girindus America Inc；Sep-Pak Light C18柱：美國WATERS公司。

1.3 實驗動物

NH小鼠，雌雄不限，體重(25±2) g；SD大鼠，雄性，體重250 g：北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證編號：SCKK(京)2012-0001)。

2 實驗方法

2.1 18F-TPT的合成

18F-TPT的合成工藝路線示于圖1，所用設備PET-MF-2V-IT-I型氟多功能合成模塊流程示意圖示于圖2。實驗步驟如下。

(1) 在模塊的反應管中預先加入0.1 mL氨水。

(2) 加速器Sumitomo HM-20S通過18O(p，n)18F反應生成18F-，將多功能模塊上QMA柱進口端接頭直接與1號瓶進液端連接(不接QMA)，將攜18F-的H218O直接轉移到反應管。

(3) 待約2.2 mL含有18F-的H218O加入反應管后，將2號瓶中6 mL無水乙腈加入2 mL，通入氮氣并115 ℃加熱除水，當反應管內剩余約2 mL溶液時，再加入2 mL無水乙腈，同樣除水至剩余2 mL溶液，最后將2號瓶剩余乙腈加入并蒸發至反應管中殘余0.2 mL溶液。

圖1 18F-TPT合成工藝路線圖Fig.1 Radiosynthesis of 18F-TPT

(4) 加入3號瓶溶于1 mL乙腈的前體(4-硝基苯基)三苯基磷硝酸鹽，120 ℃加熱將液體蒸干，將溫度升至205 ℃，打開V9，開放體系親核反應進行15 min。冷卻至室溫后加入4號瓶中1 mL乙腈，溶解后加入5號瓶中3 mL注射用水，最終溶液收集到中轉瓶。

(5) 溶液自動裝于Loop環中，通過半制備HPLC分離。分離柱為Grace Alltima C18，5 μm，10 mm×250 mm，流動相為0.01 mol/L ，pH磷酸鹽緩沖溶液，流速為5 mL/min，5 min后更換為35%乙醇溶液(含0.01 mol/L 磷酸)。待產品出峰收集。

(6) 收集的產品進行稀釋并通過C18柱，最終用1 mL無水乙醇淋洗至無菌瓶，加生理鹽水至合適體積。

2.2 18F-TPT的質量控制

目測觀察18F-TPT溶液顏色、澄清度和外觀；pH試紙測定；測定不同時間的活度值，用半對數作圖法計算半衰期；用PTS快速檢測最終產品中的細菌內毒素；用液質聯用法測定K2.2.2的含量；通過氣相色譜法測量產品中乙腈殘留；分析性HPLC測定產品放化純度，產品與標準品同時進樣，通過對比紫外峰與放射峰鑒定18F-TPT，流動相為35%乙醇水溶液(含0.01 mol/L pH磷酸)，流速為1 mL/min。

圖2 合成模塊流程示意圖Fig.2 18F-TPT synthesis system

2.3 18F-TPT的體外穩定性

18F-TPT溶液制備后置于室溫，利用分析型HPLC分別測定放置1、2、3、4、5、6 h后放化純度。

2.4 18F-TPT在正常NH小鼠體內分布

NH小鼠25只，編號后隨機分成5組，每組小鼠尾靜脈注射3.7 MBq(100 μCi)的18F-TPT，于注射后0、30、60、90、120 min處死，取血、心、肝、脾、肺、腎、骨、肌肉稱重，并在自動定標器上測放射性計數，計算每克組織放射性攝取率(%ID/g)。

2.5 正常SD大鼠Micro-PET/CT顯像

將18F-TPT溶液稀釋至37 MBq (0.2 mL)，SD大鼠經尾靜脈注射0.2 mL，給藥后30 min麻醉置于PET掃描床上，發射掃描15 min(3D采集)，迭代法重建，獲得衰減矯正后正常SD大鼠體內18F-TPT分布圖像，同時進行CT掃描，獲得與PET同步對照CT圖像。

3 結果與討論

3.1 18F-TPT的合成

利用PET-MF-2V-IT-I型氟多功能合成模塊，18F-TPT的合成時間約為1 h。由于合成初始水含量大，除水時間較長，因此將6 mL乙腈分3次加入，利用混合溶液共沸點低、蒸發快，加速除水以縮短合成時間。預置的氨水與18F-生成NH418F，與前體(4-硝基苯基)三苯基磷硝酸鹽在無溶劑環境下反應，18F-作為親核試劑進攻苯環碳，取代芳香環上硝基，屬于芳環上親核取代SnAr機理，第一步親核試劑18F-進攻苯環，形成中間體碳負離子，為雙分子反應，第二步從碳負離子中間體失去離核團硝基，恢復芳環體系并得到取代物，硝基具有強的吸電子效應，與苯環碳連接穩定，很難從苯環上離去，而且由于苯環上硝基對位的三苯基磷對苯環提供電子，使苯環電子云密度增大，不利于18F-的進攻。因此氟取代芳環上硝基的反應較難進行，例如顳葉癲癇顯像劑18F-FMZ[12]和5-羥色胺(5-HT1A)受體顯像劑18F-MPPF[13]也是由氟取代芳環硝基的親核反應，產率同樣較低。

半制備HPLC分離的放射性曲線和紫外檢測圖示于圖3，圖3a中可見產品保留時間為18.1 min，圖3b中可見相同保留時間的產品紫外峰；親核反應效率較低，有大量未反應18F-(保留時間為2.8 min)以及保留時間為4.2 min的副反應產物，產品的合成效率為12 %，18F-占總放射性活度的30%，副反應產物占58%；紫外檢測圖中可見前體于14 min被淋洗出。18F-TPT產量為740 MBq (20 mCi)，不校正合成效率為2.5%。

圖3 半制備HPLC分離的放射性曲線(a)和紫外檢測圖(b)Fig.3 Radioactive(a) and UV(b) chromatogram of semiprep HPLC

3.2 18F-TPT的質量控制

18F-TPT為無色透明溶液，pH為6～7，半衰期約為110 min，細菌內毒素含量小于5 Eu/mL，K2.2.2含量低于20 μg/L，產品中乙腈含量為0.1 g/L(美國FDA標準為低于0.4 g/L)。圖4(a)中產品18F-TPT保留時間為4.75 min，放化純度大于99.5 %，由圖4(b)可見，18F-TPT標準品的紫外保留時間為4.30 min，其中標準品紫外峰與產品放射峰相差0.45 min，由于液體先進紫外檢測器后進放射性檢測器，兩者相差0.45 min所致。由此可鑒定合成產物為18F-TPT。

圖4 產品18F-TPT的HPLC質控圖Fig.4 Analytical HPLC profiles of 18F-TPT

3.3 18F-TPT的體外穩定性研究

18F-TPT溶液在室溫下放置1、2、3、4、5、6 h后，測量放化純度仍大于95 %，表明18F-TPT體外穩定性良好。

3.4 18F-TPT在正常NH小鼠體內分布

18F-TPT在正常NH小鼠體內生物分布列于表1。注射后(0 min)可見血、心、肺有較高吸收，血液與肺內放射性清除

很快，30 min即降至0.13 %ID/g和2.82 %ID/g，并迅速達到平衡，靶器官心肌放射性攝取很高，在0、30、60、90、120 min時分別為59.8、47.3、21.7、19.0、13.6 %ID/g，30 min心與血和心與肺放射性攝取比(T/NT)分別為386和16.8，肝臟、脾臟、骨、肌肉攝取較低，30 min 心與肝的T/NT為33.1，提示18F-TPT主要經腎臟代謝。

表1 18F-TPT 在NH小鼠體內的分布

3.5 正常SD大鼠Micro-PET/CT顯像

注射18F-TPT溶液30 min后，正常SD大鼠Micro-PET/CT顯像結果如圖5(a)所示。視野內僅見心肌放射性濃聚，其余組織未見放射性濃聚。肺、肝放射性攝取與組織本底相近，不會對心肌放射性攝取的定量造成影響。結果較好的符合了注射18F-TPT溶液30 min后NH小鼠的體內分布情況。11C標記季鏻鹽類藥物碳-11-三苯基甲基磷(11C-TPT)注射30 min后正常SD大鼠顯像結果示于圖5(b)，同樣可得良好的心肌攝取以及較低的肝、肺攝取。但由于11C的短半衰期，18F-TPT的應用更廣泛。

a—18F-TPT；b—11C-TPT圖5 正常SD大鼠Micro-PET/CT顯像a— 11C-TPT；b— 11C-TPTFig.5 Micro-PET images of 18F-TPT for normal SD rats

4 小結

由于SPECT顯像價格低廉及應用廣泛，目前臨床應用上仍主要采用SPECT心肌灌注顯像診斷冠心病，但心肌灌注SPECT顯像有許多不足，其時間及空間分辨率不高，也無法對血流進行絕對定量，以及缺少組織衰減矯正的有效方法和心臟毗鄰器官的高放射性攝取，這些都會降低診斷率。PET具有較高的時間和空間分辨率，18F標記的親脂性陽離子具有合適的半衰期，心肌放射性攝取高，并能夠滯留一段時間，非靶器官清除快，能夠精確反應心肌血流，估計心肌血流量。本研究利用PET-MF-2V-IT-I型氟多功能合成模塊合成了PET心肌灌注顯像劑親脂性陽離子18F-TPT，合成時間約1 h，不矯正合成效率為2.5 %，放化純度大于99.5%，體外穩定性良好，小鼠體內分布實驗表明，18F-TPT在心肌濃聚，有較長時間滯留，血液中清除很快，PET顯像心肌輪廓明顯，肺、肝等非靶器官顯現出較快清除，對心肌顯像的干擾很少。但是，目前生產工藝耗時長，親核反應需要高溫，許多廠家模塊無法實現，并且親核效率低，仍需改進工藝，縮短合成時間，提高效率。親脂性陽離子季鏻鹽類藥物的活性基團是三苯基鏻，可以考慮修飾苯環，在苯環上連接疊氮，利用“點擊化學”與炔反應，能得到較高的產率。因此18F-TPT是一種較有潛力的心肌灌注顯像劑。

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