131I標(biāo)記番瀉苷A在正常小鼠體內(nèi)分布和評(píng)價(jià)心肌活性研究

王俊虎 ，蔣翠花，江 驍，李 玥， 孫自平，殷志琦，張 健，倪以成,4

(1.中國藥科大學(xué) 天然藥物化學(xué)教研室, 江蘇 南京 210009；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 210028；3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所, 山東 濟(jì)南 564314；4.比利時(shí)魯汶大學(xué)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)影像部, 比利時(shí) 魯汶 BE-30000)

冠心病是心血管疾病中發(fā)病率、死亡率較高的疾病。冠心病患者心肌梗死后梗死區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞會(huì)變性壞死，形成壞死組織，不可再生。壞死組織的面積是急性心肌梗死的重要預(yù)后指標(biāo)。急性心肌梗死的梗死區(qū)域可能存在著相當(dāng)數(shù)量的存活心肌，可能在血流重建后或自發(fā)恢復(fù)心肌活力[1]。準(zhǔn)確的識(shí)別冠心病患者的缺血心肌是否可逆對(duì)治療方案的選擇具有決定性的作用。因?yàn)樾募」Ｋ赖男呐K上可能同時(shí)存在著冬眠心肌、頓抑心肌和壞死心肌，前兩者屬于可恢復(fù)功能的存活心肌[2-3]。如果患者已經(jīng)形成了大面積不可逆的心肌梗死，此時(shí)存活心肌已很少，血流重建術(shù)治療的療效不僅很差，而且可能造成再灌注損傷加重病情[4]，應(yīng)選擇的治療方案是心臟移植或者對(duì)癥治療[1]。如果情況相反，心肌梗死病變區(qū)域還存在著較多的存活心肌(冬眠心肌、頓抑心肌)，積極的再灌注措施可能使其功能形態(tài)恢復(fù)[5]。因此心肌梗死的準(zhǔn)確診斷，對(duì)于冠心病的治療有重要意義。

現(xiàn)在臨床上用于檢測(cè)存活心肌的方法主要有磁共振成像(MRI)[6]、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)、單光子發(fā)射斷層掃描(SPECT)[1]和心電圖[7]等，通過檢測(cè)心肌細(xì)胞心肌纖維化，細(xì)胞

新陳代謝和血流灌注來評(píng)價(jià)心肌存活情況。但是由于每種方法都存在局限性，降低了診斷的準(zhǔn)確率[8]。 近期研究發(fā)現(xiàn)，萘并二蒽酮類化合物金絲桃素，具有壞死組織親和性[9]，國外有學(xué)者利用放射性碘標(biāo)記金絲桃素示蹤發(fā)現(xiàn)，金絲桃素選擇性聚集在腫瘤中心壞死組織上[10]，F(xiàn)onge等[11]發(fā)現(xiàn)金絲桃素可以與梗死心肌特異性結(jié)合，應(yīng)用于心肌梗死的壞死區(qū)域檢測(cè)。番瀉苷A是一種中位二蒽酮類化合物，具有與金絲桃素相似的空間結(jié)構(gòu)，可能也具有相同的活性，其結(jié)構(gòu)圖示于圖1。為考察番瀉苷A的壞死組織親和性和評(píng)價(jià)應(yīng)用于檢測(cè)心肌細(xì)胞存活性的潛力，通過131I標(biāo)記番瀉苷A，研究其在心肌梗死模型大鼠上的分布，探討檢測(cè)壞死心肌細(xì)胞的可行性。

圖1 番瀉苷(A)和金絲桃素結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of sennoside A and hypericin

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與裝置

RM-905a活度計(jì)：中國計(jì)量科學(xué)研究院研制；SN-697伽馬計(jì)數(shù)器：上海核所日環(huán)光電儀器有限公司；小動(dòng)物呼吸機(jī)：上海奧爾科特生物科技有限公司；cyclone plus磷屏掃描儀：Perkin Elmer公司。

1.2 主要藥物與試劑

番瀉苷A：sennoside A，純度大于98%，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；DMSO：分析純，天津博迪化工有限公司；Iodogen試劑：美國Sigma公司；濃鹽酸：分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；Na131I溶液：原子高科股份有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑：TTC，上海靈錦精細(xì)化工有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠：雄性，200～300 g，SPF級(jí)，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。KM小鼠：雄性，20～25 g，SPF級(jí)，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠心肌梗死模型的建立

SD大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 μL/g)。麻醉后大鼠仰面固定于鼠臺(tái)上，經(jīng)口氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸頻率60～80次/min，呼吸比1/1，潮氣量4 μL/g。碘伏皮膚消毒后，沿胸骨左緣3、4肋間開胸，暴露心臟，剝離心包膜，在室間溝處左心耳下方平行穿線，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。結(jié)扎后，抽出胸腔空氣，恢復(fù)胸腔負(fù)壓，快速縫合胸腔，撤出氣管插管，每只大鼠肌肉注射青霉素16萬個(gè)單位。

2.2 131I標(biāo)記番瀉苷A溶液的制備

2.2.1標(biāo)記條件的優(yōu)化

1)反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響

取200 μL番瀉苷A的DMSO溶液(0.2 g/L)加入Iodogen含量為20 μg的制備涂管中，然后加入50 μL的7.4 MBq Na131I溶液，振蕩搖勻，室溫反應(yīng)。分別取5、15、30、60 min的反應(yīng)液用紙層析法測(cè)定標(biāo)記率，Whatman濾紙作為載體，0.1 mol/LHCl作為流動(dòng)相展開。

2)番瀉苷A的用量對(duì)標(biāo)記率的影響

分別取200 μL濃度為0.05 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.5 g/L的番瀉苷A的DMSO溶液加入Iodogen含量為20 μg的制備涂管中，然后加入50 μL的7.4 MBq Na131I溶液振蕩搖勻，室溫反應(yīng)30 min，終止反應(yīng)后，用紙層析法測(cè)定標(biāo)記率。

3)Iodogen的用量對(duì)標(biāo)記率的影響

取Iodogen含量為5、10、20、40 μg的制備涂管，分別加入200 μL番瀉苷A的DMSO溶液(0.2 g/L)然后加入50 μL的7.4 MBq Na131I溶液，振蕩搖勻，室溫反應(yīng)30 min，終止反應(yīng)后，用紙層析法測(cè)定標(biāo)記率。

2.2.2131I標(biāo)記番瀉苷A的體外穩(wěn)定性

將0.1 mL131I標(biāo)記番瀉苷A溶液(活度約為11.1 MBq)加入至0.3 mL DMSO中，振蕩搖勻，于室溫條件下放置2、4、6、10、24、48 h后，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用紙色譜法測(cè)定放化純度。

2.3 131I標(biāo)記番瀉苷A在正常小鼠體內(nèi)分布

將配制好的131I標(biāo)記番瀉苷A溶液加入PEG 400與丙二醇以1∶1體積比的配比溶液稀釋3倍。取雄性昆明小鼠9只(實(shí)驗(yàn)前一天喂食1%碘化鉀溶液)，隨機(jī)分3組，每組3只，每只尾靜脈注射稀釋后的131I標(biāo)記番瀉苷A溶液0.37 MBq，分別在注射后4、24、48 h斷頭處死，取各臟器(甲狀腺，腎臟，肝臟，脾臟，肺，心，小腸，胃，肌肉，骨骼，毛皮)分別稱重并用伽馬計(jì)數(shù)器測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，經(jīng)衰變和背景校正后，計(jì)算每克臟器或組織的放射性攝取率(%ID/g)。

2.4 131I標(biāo)記番瀉苷A在心肌梗死模型大鼠體內(nèi)分布

將配制好的131I標(biāo)記番瀉苷A溶液加入由PEG 400與丙二醇以體積比1∶1配比溶液稀釋3倍。取心肌梗死模型大鼠6只(實(shí)驗(yàn)前一天喂食1%碘化鉀溶液)，每只尾靜脈注射稀釋后的131I標(biāo)記番瀉苷A溶液3.7 MBq。24 h后，安樂處死模型大鼠，取各臟器(甲狀腺、腎臟、肝臟、脾臟、肺、正常心肌、梗死心肌、小腸、胃、肌肉和毛皮等)，分別稱重并用伽馬計(jì)數(shù)器測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，經(jīng)衰變和背景校正后，計(jì)算每克臟器或組織的放射活性攝取率(%ID/g)。

2.5 TTC染色和放射自顯影

取模型大鼠離體心臟制成2 mm厚的切片，避光條件下用2 %的TTC溶液37 ℃孵育15 min。取TTC染色后的心臟切片，在暗室4 ℃下作用于高分辨感光磷屏曝光1 h，曝光結(jié)束后用磷屏掃描儀掃描顯像。

3 結(jié)果與討論

3.1 大鼠心肌梗死模型的建立

采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支法建立大鼠急性心肌梗死模型，手術(shù)過程如圖2所示。結(jié)扎后心臟形成心肌梗死，病變部位心肌會(huì)缺血變?yōu)榘咨鐖D3所示。

圖2 大鼠心臟手術(shù)結(jié)扎圖Fig.2 Image of Heart surgery in rats

圖3 心肌梗死心臟Fig.3 Image of infarcted heart

3.2 131I標(biāo)記番瀉苷A溶液的制備

3.2.1標(biāo)記條件的優(yōu)化

1)反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響

采用紙層析法測(cè)定標(biāo)記率，游離的131I分布在前沿，而131I標(biāo)記番瀉苷A保留在原點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響示于圖4。標(biāo)記率隨著時(shí)間的延長逐漸增高，30 min時(shí)達(dá)到90.3 %，繼續(xù)反應(yīng)標(biāo)記率變化不明顯，最佳反應(yīng)時(shí)間確定為30 min。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記率的影響Fig.4 Effect of reaction time on labeling yield

2)番瀉苷A的用量對(duì)標(biāo)記率的影響

番瀉苷A的用量對(duì)標(biāo)記率的影響示于圖5。標(biāo)記率隨著番瀉苷A的用量增加而逐漸增高，當(dāng)番瀉苷A的濃度為0.2 g/L時(shí)標(biāo)記率達(dá)提高90.3%，繼續(xù)確定反應(yīng)濃度為0.2 g/L。

圖5 番瀉苷A的用量對(duì)標(biāo)記率的影響Fig.5 Effect of concentration of Sennoside A on labeling yield

圖6 Iodogen用量對(duì)標(biāo)記率的影響Fig.6 Effect of Iodogen mass on labeling yield

3)Iodogen的用量對(duì)標(biāo)記率的影響

Iodogen的用量對(duì)標(biāo)記率的影響示于圖6。其他條件不變，Iodogen用量為20 μg之前，標(biāo)記率隨著用量的增加而增高，在20 μg時(shí)達(dá)到90.3 %，之后隨著氧化劑用量的增加而下降，分析原因可能是番瀉苷A的標(biāo)記過程首先是Iodogen氧化劑將Na131I溶液中的I-氧化形成大部分I+離子及少部分的高價(jià)態(tài)的碘酸根離子，然后I+通過親電取代反應(yīng)取代番瀉苷A活性部位上的H+，得到131I標(biāo)記番瀉苷A。隨著氧化劑用量的增加，被氧化的I-量增加，標(biāo)記率上升，當(dāng)氧化劑達(dá)到20 μg已經(jīng)足夠?qū)⑺械腎-氧化成I+，這時(shí)再增加氧化劑用量可能會(huì)將I-氧化成高價(jià)態(tài)的碘酸根離子，導(dǎo)致實(shí)際參與反應(yīng)的I+量減少，標(biāo)記率隨著氧化劑用量的增加而下降，因此在制備131I標(biāo)記番瀉苷A時(shí)，應(yīng)該將氧化劑用量控制在20 μg。

3.2.2131I標(biāo)記番瀉苷A的體外穩(wěn)定性

131I標(biāo)記番瀉苷A溶液的體外穩(wěn)定性結(jié)果示于圖7。室溫條件下放置24 h，其放化純度仍保持在90 %以上，48 h時(shí)放化純度為89.9 %，說明131I標(biāo)記番瀉苷A體外穩(wěn)定性較好。

圖7 131I標(biāo)記番瀉苷A體外穩(wěn)定性Fig.7 131I-Sennoside A’s vitro stability

3.3 131I標(biāo)記番瀉苷A在正常小鼠體內(nèi)的分布

131I標(biāo)記番瀉苷A在正常小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表1。由表1可知，在血液清除較快，給藥4 h時(shí)，血液的放射性攝取為3.052 %ID/g，24 h時(shí)降為0.461 %ID/g，48 h為0.243 %ID/g；腎臟放射性攝取高，4 h時(shí)為4.656 %ID/g，24 h后為2.674 %ID/g，48 h時(shí)為1.597 %ID/g；藥物在鼠體表面如肌肉、骨骼、毛皮等放射性攝取較少。注射后24 h，大多數(shù)器官及組織的放射性攝取小于1%ID/g，注射后48 h，標(biāo)記物基本上從各器官清除。而金絲桃素在小鼠體內(nèi)主要通過肝臟代謝，在腎臟的分布很少[11]。比較金絲桃素和番瀉苷A的結(jié)構(gòu)，金絲桃素屬于脂溶性化合物，而番瀉苷A由于多了兩個(gè)糖苷鍵和兩個(gè)羧基，水溶性較金絲桃素強(qiáng)，推測(cè)番瀉苷A在小鼠體內(nèi)主要是通過腎臟排泄。

3.4 131I標(biāo)記番瀉苷A在心肌梗死模型大鼠體內(nèi)分布

131I標(biāo)記番瀉苷A在心肌梗死大鼠上的分布結(jié)果列于表2。注射標(biāo)記物24 h后，壞死心肌的放射性攝取率為1.537%ID/g，正常心肌為0.129%ID/g，壞死心肌和正常心肌的放射性攝取率比為11.9。血液分布很少為0.096%ID/g，其他各臟器較低，結(jié)果表明，番瀉苷A具有壞死心肌親和性。但是腎臟為0.923%ID/g，這與正常小鼠體內(nèi)分布結(jié)果一致，提示番瀉苷A是水溶性化合物，經(jīng)靜脈注射后在大鼠體內(nèi)的代謝主要通過腎臟。

表1 131I標(biāo)記番瀉苷A在正常小鼠體內(nèi)的生物分布Table 1 Biodistribution of 131I-iodosennoside

表2 131I標(biāo)記番瀉苷A在心肌梗死大鼠體內(nèi)的生物分布Table 2 Biodistribution of 131I-iodosennosideA in Rat model of myocardial ,n=6)

3.5 TTC染色和放射自顯影

TTC試劑可以與正常心肌細(xì)胞中的脫氫酶反應(yīng)而染成紅色，壞死心肌細(xì)胞由于細(xì)胞膜破裂，脫氫酶被完全釋放所以不被染色。心臟經(jīng)過TTC染色后的紅色區(qū)域代表正常心肌，而白色區(qū)域就是心肌梗死區(qū)域(如圖8 A所示)。圖8B放射自顯影圖像中，箭頭所指的紅色區(qū)域就是放射性核素即131I標(biāo)記番瀉苷A的分布區(qū)域，與其相對(duì)應(yīng)的TTC染色圖片進(jìn)行比較后，可以發(fā)現(xiàn)，131I標(biāo)記番瀉苷A在白色心肌壞死區(qū)域選擇性聚集，而在紅色正常心肌區(qū)域幾乎沒有聚集，驗(yàn)證了131I標(biāo)記番瀉苷A對(duì)于壞死心肌的親和性。

圖8 心臟切片TTC染色圖(A)和心臟切片磷屏自顯影圖片(B)Fig.8 Images of 2mm myocardial slices, after TTC staining (A); Autoradiograms of 2mm myocardial slices, correspond to TTC images (B)

4 結(jié)論

番瀉苷A與梗死心肌特異性結(jié)合，能夠在大鼠的壞死心肌區(qū)域靶向分布，除腎臟外，在正常器官清除較快，在心肌梗死診斷方面具有開發(fā)的前景。

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