Re/99Tcm(CO)3+-二苯基二氮烯類化合物Aβ顯像劑的制備以及生物評價

楊 洋，崔孟超，湯睿昆，吳 瑞，朱 霖，張華北

(教育部放射性藥物重點實驗室 北京師范大學 化學學院, 北京 100875)

Aβ淀粉樣斑塊在阿爾茨海默病(又稱老年癡呆癥)的發病過程中起著關鍵作用，因此，利用PET/SPECT技術以及相應的放射性標記物對腦內Aβ斑塊進行顯像，可以無創診斷老年癡呆癥[1-3]。一些Aβ斑塊顯像劑已經有報導，例如18F標記的FDDNP，FMAPO，stilbenes[4-6]，11C標記的PIB 和SB-13[7-8]，123I標記的IMPY[9]。但基于99Tcm標記Aβ斑塊顯像劑的發展比較滯后，目前為止只有少數研究發表，包括99TcmO(UBAT)[10]，99Tcm-MAMA-2-(4-aminophenyl)benzothiazole[11]，[99Tcm(CNtBu)4(bpcr)]+， [99Tcm(CNtBu)4(bpcg)]+ [12]。99Tcm標記藥物作為Aβ斑塊顯像劑發展緩慢主要是由于較低的腦攝取，但是該核素具有很好的理化性質，其半衰期適中(6 h)，純γ射線和能量適中(140 keV)，成本低廉(由99Mo/99Tcm發生器生產)，因此在核醫學領域應用廣泛[13]。由于99Tcm沒有穩定同位素，因此Re作為99Tcm的同族元素，常用于其穩定化合物的物理化學性質研究以及結構鑒定[14-15]。

本研究設計二苯基二氮烯類衍生物并制備了99Tcm(CO)3+-L(L為(E)-2-(4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯基氨基)乙酸)以及穩定化合物Re(CO)3+-L，并對其紫外吸收和熒光染色進行了分析，同時基于放射性自顯影和熒光染色的方法分別研究了Re/99Tcm(CO)3+-L與Aβ斑塊的結合能力，并進行99Tcm(CO)3+-L在正常小鼠體內生物分布實驗，研究99Tcm(CO)3+-L作為二苯基二氮烯類衍生物成為AD靶向藥物的可能性。

1 主要實驗材料

1.1 試劑和儀器

99Mo/99Tcm發生器：北京欣科思達醫藥科技有限公司產品；[99Tcm(CO)3(H2O)3]+：參照文獻[16]制備，并于制備后立即使用；Re(CO)5Br、4-(N,N-二甲基)苯基-4’-氨基苯基二氮烯、2-溴乙酸叔丁醇酯、硫磺素-T：阿法埃莎天津化學有限公司；其他試劑均購自北京化學試劑公司。

Bruker-400 NMR核磁共振儀(1H/13C NMR)：美國Varian公司產品；TM串聯四極桿質譜儀：英國Micromass公司產品；AVATAR360傅里葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)：美國Nicolet公司產品；1470 Wizard自動γ計數器：美國Wallac公司產品；Fluorolog Tau-3熒光分光光度計：法國J-Y公司產品；Cintra 10 紫外-可見分光光度計：澳大利亞GBC公司產品；蔡司LSM510 META激光掃描共聚焦顯微鏡：德國Zeiss公司產品；Cyclone Phosphor-imager成像系統：美國Perkin-Elmer公司產品；LEICA CM1900冰凍切片機：德國Leica公司產品。

1.2 實驗動物

AD小鼠(TgC57，APP，PS1 12個月)：中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，AD鼠大腦切片厚度為20 μm；正常昆明小鼠15只，18～20 g：北京大學動物中心。

2 實驗方法

2.1 配體L以及Re(CO)3+-L的合成

Re/99Tcm(CO)3+-L以及4-(N,N-二甲基)苯基-4’-氨基苯基二氮烯的化學結構示于圖1。具體合成步驟示于圖2。

2.1.1(E)-2-(4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯基氨基)乙酸叔丁醇酯(化合物B)

0 ℃條件下，1.3 g 2-溴乙酸叔丁醇酯(6.7 mmol)和1.4 g KHCO3(14 mmol)混合的DMF溶液(150 mL)中滴加4-(N,N-二甲基)苯基-4’-氨基苯基二氮烯(化合物A)(1.4 g，5.8 mmol，20 mL DMF)，并不斷攪拌；滴加完畢后，將反應體系溫度緩慢升高到50 ℃，并攪拌24 h；將反應體系自然冷卻至室溫，滴加飽和NaHCO3溶液調節體系pH至7，用乙醚萃取有機相，并用飽和NaHCO3溶液洗三次，洗滌后的有機相用飽和NaCl溶液再次洗滌除去溶液中的DMF，經過旋轉蒸發干燥得到粗產品，用硅膠柱分離(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1，Rf= 0.5)得到1.5 g 紅棕色化合物B，產率為75%。

圖1 Re/99Tcm(CO)3+-L以及4-(N,N-二甲基)苯基-4’-氨基苯基二氮烯的化學結構Fig.1 Chemical structures of Re/99Tcm(CO)3+-L and (E)-4-((4-aminophenyl)diazenyl)-N,N-dimethylaniline

A→B: 2-溴乙酸叔丁醇酯, KHCO3, DMF, 50 ℃, 24 h; B→L: CF3COOH, CH2Cl2, RT, 72 h; L→Re(CO)3+-L: Re(CO)5Br, KOH, H2O, 加熱回流, 24 h; L→99Tcm(CO)3+-L: [99Tcm(CO)3(H2O)3]+, H2O, pH = 9～10, 100 °C, 30 min圖2 99Tcm(CO)3+-L的合成路線A→B: tert-butyl 2-bromoacetate, KHCO3, DMF, 50 ℃, 24 h; B→L: CF3COOH, CH2Cl2, RT, 72 h; L→Re(CO)3+-L: Re(CO)5Br, KOH, H2O, reflux, 24 h; L→99Tcm(CO)3+-L: [99Tcm(CO)3(H2O)3]+, H2O, pH = 9～10, 100 °C, 30 minFig.2 The Synthesis of 99Tcm(CO)3+-L

2.1.2(E)-2-(4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯基氨基)乙酸(L)

500 mg化合物B(1.4 mmol)的CH2Cl2溶液中(150 mL)加入684 mg 乙酸(6 mmol)，在室溫下攪拌72 h；反應完畢后用飽和NaHCO3溶液調節體系pH至7～8，加入CH2Cl2萃取粗產品，并用硅膠柱分離(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1，Rf= 0.1)，得到深紅色固體350 mg，配體L產率為84%。

2.1.3Re(CO)3+-L

70 mg Re(CO)5Br (0.17 mmol)，52 mg配體L(0.17 mmol)以及10 mgKOH(0.17 mmol)同時加入到50 mL蒸餾水中，100 ℃條件下攪拌24 h，反應完畢后使體系溫度自然冷卻至室溫，粗產品用CHCl3萃取后旋轉蒸發干燥，用硅膠柱以V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1除去雜質并用乙醇洗下目標產物，得到紫色配合物100 mg，產率為76%。

2.2 [99Tcm(CO)3+(H2O)3]+放射性標記

2.2.199Tcm(CO)3+-L的制備

1 mL [99Tcm(CO)3(H2O)3]+(92.5 MBq/mL)[16]的溶液加入3 mL配體L (0.2 g/L)，pH調節到9～10，沸水浴條件下反應30 min。

2.2.2TLC分析

藝術源于生活，高于生活。色彩真真實實地存在于我們的生活當中，所以在小學美術教學中，教師可以借助生活中的色彩對學生進行刺激，據此培養學生的色彩認知能力。例如，穿著粉色系裙子的女生，能夠給人溫暖、溫馨的感受，和女生安靜、自然的性格十分符合。通過教師這樣的講解，學生能夠感受到不同的色彩給人以不同的感受，刺激學生對色彩的認知。此外，教師可以引導學生進行服裝創作，自己設計服裝，并進行色彩搭配，之后說一說這樣搭配的理由。這樣一來，學生能夠發現色彩就在我們的身邊，使學生能夠主動從生活中去尋找色彩，并用色彩裝扮自己、裝扮生活。

聚酰胺紙條(10 cm×0.5 cm)為固定相，CH3CN作為展開劑，分別測定[99Tcm(CO)3(H2O)3]+和99Tcm(CO)3+-L在固定相的放射性計數，計算Rf。

2.2.3紙電泳

0.025 mol/L pH 7.4 PBS作為電泳液，新華1號濾紙作為固定相，電壓150 V，180 min，測定標記物99Tcm(CO)3+-L在固定相上的放射性計數。

2.2.4脂水分配系數

將5 mL正丁醇與5 mL PBS溶液充分混合，加入約(1.85 MBq99Tcm(CO)3+-L，渦旋震蕩5 min，6 000 r/min離心分離1 min，取出1 mL有機相再與4 mL正丁醇和5 mL PBS溶液充分混合，渦旋震蕩5 min，再6 000 r/min離心分離1 min，如此重復三次，分別取出最后一次的有機相和水相各0.1 mL，測定其放射性計數。

2.3 放射性自顯影

取少量99Tcm(CO)3+-L (0.3 TBq/L)滴加到AD鼠腦切片上，室溫下靜置1 h，分別用40% EtOH (H2O, v/v%)溶液和水洗滌掉切片上沒有結合的99Tcm(CO)3+-L，將洗滌過的切片靜置晾干，然后置于Cyclone Phosphor-imager成像系統曝光12 min。

2.4 紫外吸收和熒光光譜

將1 g/L的配體L和Re(CO)3+-L分別放入紫外分光光度計，進行吸收波長掃描(200～1 000 nm)，找出其最大吸收波長；將相同濃度的配體L和Re(CO)3+-L分別放入熒光光度計，進行發射波長掃描，找出最大發射波長，并通過最大發射波長(Em)找出其相應的最大激發波長(Ex)。

2.5 熒光染色

將Re(CO)3+-L溶液 (1 mmol/L, 溶于0.5% DMSO)滴加到AD鼠腦組織切片上，室溫下靜置1 h，分別用40%的EtOH溶液和純水洗掉沒有結合的Re(CO)3+-L，再將切片放置于室溫下自然晾干，熒光染色后通過激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察，并與硫磺素-T染色后的AD腦切片進行對比。

2.6 正常小鼠體內生物分布

取正常小鼠15只，分為5組，每組3只，將0.1 mL新制備的99Tcm(CO)3+-L (0.93～1.11 MBq)尾靜脈注射入昆明小鼠體內，分別于注射后5、15、30、60、120 min斷頸處死，分別測定血液以及其他臟器的質量和放射性計數，然后計算每克組織的放射性攝取率(%ID/g)。

3 結果和討論

3.1 配體L以及Re(CO)3+-L的合成

合成化合物均由紅外(IR)、核磁共振(1H NMR，13C NMR)以及質譜(ESI-MS)進行鑒定。

(1)化合物B的鑒定。IR (KBr): 3 406.5 cm-1，2 973.7 cm-1，2 926.3 cm-1，1 728.6 cm-1，1 597.3 cm-1，1 523.1 cm-1，1 445.5 cm-1，1 367.4 cm-1，1 232.0 cm-1，1 151.4 cm-1，1 050.0 cm-1，943.9 cm-1，828.8 cm-1，544.0 cm-1;1H NMR (CDCl3, 400 MHz)：δ7.74 (d，J = 8.0 Hz，2H)，7.70 (d，J = 8.0 Hz，2H)，6.67 (d，J = 8.0 Hz，2H)，6.56 (d，J = 8.0 Hz，2H)，3.94 (s，1H)，3.78 (s，2H)，2.97 (s，6H)，1.42 (s，9H);13C NMR (CDCl3, 100 MHz)：δ168.73，151.55，150.56，147.53，142.80，124.15，123.18，122.14，121.23，111.60，110.78，110.47，81.28，39.38，28.67，27.03; MS+(ESI)：354.99 [M+1]+。

(2)配體L的鑒定。IR (KBr): 3 415.5 cm-1，2 922.7 cm-1，2 852.2 cm-1，1 652.7 cm-1，1 638.3 cm-1，1 601.7 cm-1，1 364.9 cm-1，1 309.2 cm-1，1 262.6 cm-1，1 140.8 cm-1，945.0 cm-1，820.8 cm-1，551.5 cm-1;1H NMR (CDCl3, 400 MHz)：δ7.75 (d，J = 8.0 Hz，2H)，7.63 (d，J = 8.0 Hz，2H)，7.46 (d，J = 8.0 Hz，2H)，6.68 (d，J = 8.0 Hz，2H)，5.23 (s，1H)，4.15 (s，2H)，3.04 (s，6H); MS：m/z298.7[M+H]+，284.5 [M-CH3]+, 268.6 [M-CO]+, 240.6 [M-CH2COC(CH3)3]+。

(3)配合物Re(CO)3+-L的鑒定。IR (KBr): 3 434.4 cm-1，2 957.9 cm-1，2 851.8 cm-1，2 014.3 cm-1，1 894.2 cm-1，1 598.6 cm-1，1 516.1 cm-1，1 463.1 cm-1，1 362.8 cm-1，1 261.4 cm-1，1 098.70 cm-1，1 025.0 cm-1，803.7 cm-1；1H NMR (d6-DMSO，400 MHz):δ7.71 (d，J = 8.0 Hz, 2H)，7.65 (d，J = 8.0 Hz, 2H)，6.82 (d, J = 8.0 Hz，2H)，6.76 (s，2H), 5.97 (s，2H), 5.75 (s，1H), 5.06 (s，2H), 4.79 (s，6H)；MS:m/z392.1，394.1 [M-2CO-H2O-(CH3)2N-Ph，187Re/185Re]+，586.1，588.1 [M]+。

3.2 TLC分析

[99Tcm(CO)3(H2O)3]+中間體和標記產物99Tcm(CO)3+-L在乙腈和聚酰胺體系下Rf分別為0.1和0.6～0.7，同時，TLC分析也表明99Tcm(CO)3+-L的放化純度大于95%。

3.4 紙電泳

紙電泳實驗表明，在6 h后，超過95%的99Tcm(CO)3+-L仍然在原點，說明該標記物在pH 7.4條件下為中性。

3.5 99Tcm(CO)3+-L的脂水分配系數

99Tcm(CO)3+-L 的脂水分配系數為0.344±0.057，說明該化合物有一定的脂溶性，但其脂溶性與文獻報道(2.90[11]，2.89～3.61[17])锝標記的Aβ斑塊顯像劑相比明顯較低，這不利于該標記物在腦內攝取。

3.6 紫外吸收和熒光光譜

配體L的紫外吸收分別在250 nm (中等強度)，320 nm (弱)，415 nm (很強)，而配合物Re(CO)3+-L的紫外吸收在450 nm處(見圖3)，二者對比后者發生了紅移，說明三羰基Re核心對配體的紫外發光性質產生了影響，錸配合物的紫外吸收屬于典型的低能吸收可歸屬為MLCT躍遷(金屬—配體荷移躍遷)，不同于配合物自身的π→π*躍遷(自旋允許的S0→1IL)，該種躍遷可被視為是長波長的S0→1MLCT躍遷。

熒光發射光譜表明，配合物Re(CO)3+-L相對于配體L明顯發生紅移，從368 nm紅移至415 nm，波長改變為47 nm(見圖4)；熒光發射波長發生紅移是典型的金屬配合物的性質，可以解釋為自旋禁止的S0←3MLCT躍遷，也就是“Stokes位移”。

圖3 配體 L 和配合物Re(CO)3+-L的紫外吸收光譜Fig.3 UV-vis absorption spectroscopy of L(a) and Re(CO)3+-L(b)

圖4 配體 L和配合物Re(CO)3+-L的熒光發射光譜Fig.4 Fluorescence emission spectra of L and Re(CO)3+-L

3.7 熒光染色和放射性自顯影

配合物Re(CO)3+-L已知的熒光發射波長為415 nm，但是在與AD鼠腦切片中的Aβ斑塊結合后，其發射波長變為505 nm(激發波長也產生了相應的變化)，間接說明二者通過相互作用改變了配合物的熒光性質；硫磺素-T被認為是尸檢AD的“金標準”[18]，通過與硫磺素-T染色的AD鼠腦切片中的Aβ斑塊進行對比，發現配合物Re(CO)3+-L與硫磺素-T可以指示相同位置的Aβ斑塊，這說明Re(CO)3+-L可以很好地染色Aβ斑塊；同時，放射性自顯影結果也表明，99Tcm(CO)3+-L可以指示Re(CO)3+-L標記出的Aβ斑塊，二者具有相同的與Aβ斑塊結合的能力(見圖5)。

3.8 99Tcm(CO)3+-L 的生物分布

99Tcm(CO)3+-L 在小鼠體內的攝取和分布列于表1。結果表明，該標記物初始腦攝取相對較高(5 min，(0.52±0.11)%ID/g)，但120 min內清除不是很快，大約仍有50%活度滯留腦內(120 min，(0.28±0.04)%ID/g)；同時，在心臟、肝、肺的初始攝取較高，并在120 min后仍有較高滯留；在血液中的提取較高，清除較慢。

圖5 AD鼠腦切片熒光染色(左四圖)與放射性自顯影(右兩圖)對比Fig.5 Comparison of fluoresce staining results and radioautography of brain slices of AD mouse

組織放射性攝取率/(%ID·g-1)5 min15 min30 min60 min120 min腦0.52±0.110.33±0.060.36±0.070.31±0.060.28±0.04血10.03±2.337.90±1.207.55±1.425.83±0.534.51±0.53心臟5.92±0.792.76±0.613.09±0.692.46±0.482.02±0.26肝14.99±1.2611.28±3.0213.75±1.1112.69±1.1412.45±1.26脾7.34±0.764.43±1.095.29±0.925.06±1.184.31±0.94肺10.45±1.516.29±1.256.57±1.524.63±0.904.26±0.42腎20.74±0.4513.71±2.6613.30±1.0114.25±0.9714.47±2.48肌肉3.31±0.732.02±0.312.71±0.561.37±0.601.44±0.45骨6.20±1.923.35±0.694.99±0.583.80±1.684.56±1.56

4 結論

與文獻報道的锝標記的藥物相比，99Tcm(CO)3+-L在正常小鼠腦內有相對較低的腦攝取，且腦清除較慢，這可能是與該標記物脂溶性不高較難穿過血腦屏障有關，另外與99TcmO核相比锝羰基核較大的體積也限制了其相應標記物進入腦組織。99Tcm標記的二苯基二氮烯類化合物雖然在體外與Aβ斑塊有結合，作為Aβ顯像劑其在生物體內吸收以及代謝尚不理想，有待進一步研究。針對該化合物進腦量低，代謝慢等缺點進行的結構改造正在進行中。

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