4—羥基苯乙酸對酪氨酸酶作用機理研究

摘 要：本實驗研究了4-羥基苯乙酸對酪氨酸酶的作用機理。實驗結果表明：在低濃度條件下，4-羥基苯乙酸對酪氨酸酶具有激活抑制作用；在高濃度條件下，4-羥基苯乙酸對酪氨酸酶具有抑制作用。

關鍵詞：酪氨酸酶 4-羥基苯乙酸 激活作用

中圖分類號：Q356.1 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2013）01（a）-00-01

酪氨酸酶（Tyrosinase），又稱多酚氧化酶，是一種含銅金屬酶，廣泛存在于細菌、真菌、裸子植物、被子植物、哺乳動物等生物中，并存在于生物界系統發育階段的各個水平。一般認為，羽毛，毛發，眼睛，昆蟲表皮，種子等呈現出黑色、褐色、淺黃色等色素，都是酪氨酸酶作用的結果。酪氨酸酶的產物黑色素具有抗紫外線、清除自由基、抗病毒等重要功能。最新研究結果表明，可利用黑色素制備相應的抗體來治療與酪氨酸酶表達相關的疾病。因此，國內外很多學者都致力于尋找具有特異的、高效的酪氨酸酶作用物，研究其抑制或激活的作用機理和動力學。該文以4-羥基苯乙酸作為效應物，研究其對酪氨酸酶催化反應的影響及作用動力學，得到有關動力學參數，為酪氨酸酶抑制劑和激活劑的分子設計的實際應用提供理論依據。

1 實驗方法

1.1 材料及儀器

蘑菇酪氨酸酶（Mushroom tyrosinase）購于Sigma公司，總活力為50 KU。L-3，4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA）購于上海斯高勒生物技術有限公司。對羥基苯乙酸、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）和磷酸二氫鈉（NaH2PO4）等試劑均為國產分析純。儀器為上海UNICO公司UV-2102PC型紫外可見分光光度計。

1.2 酪氨酸酶酶活測定

以1.0 mM L-DOPA為底物。先將0.6 mL 5 mM的L-酪氨酸（溶于pH 6.8的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液）溶液置于石英比色皿中，加入2.28 mL pH 6.8的Na2HPO4- NaH2PO4緩沖液，置于30 ℃恒溫水浴中恒溫10 min，加入90 μL含不同濃度的4-羥基苯乙酸溶液和0.8 mg/mL酪氨酸酶水溶液，測定OD475。此測活體系中，酶的終質量濃度為1.0 μg/mL。

2 結果與討論

2.1 4-羥基苯乙酸對酪氨酸酶的影響

如圖1所示，固定酪氨酸酶催化反應體系中的終質量濃度為0.55 μg/mL，底物L-DOPA的濃度為1.0 mmol/L。結果表明，在4-羥基苯乙酸濃度在10.0 mmol/L以內，對酪氨酸酶催化氧化L-DOPA起激活作用，并且激活作用隨4-羥基苯乙酸濃度的激活程度是先增加后下降，在2.0 mmol/L濃度左右，酶催化活力變為原來的2.4倍。當酶催化反應體系中4-羥基苯乙酸的濃度超過10 mmol/L，4-羥基苯乙酸對酪氨酸酶起抑制作用，當4-羥基苯乙酸濃度為15.0 mmol/L時，酶催化活力變為原來的20%。

2.2 4-羥基苯乙酸對酪氨酸酶作用機理分析

黑色素的合成途徑一般被分為兩個階段：遠端步驟和近端步驟。近端步驟包括單酚和/或鄰-二酚的酶氧化，由含銅酪氨酸酶催化形成鄰醌；遠端步驟包括化學反應和酶反應，最終合成黑色素。（見圖2）

在雙酚酶催化循環中，還原態酶（Emet）與雙酚（D）非共價結合，雙酚上的羥基被親核試劑進攻釋放出2個H+，生成的復合物Emet-D分解釋放出醌（Q）、水和脫氧態酶（Edeoxy）。

Edeoxy結合氧氣生成氧化態酶（Eoxy），Eoxy可結合單酚也可以結合雙酚，結合雙酚后繼續進行雙酚循環，雙酚與氧化態酶非共價結合，雙酚上的羥基被親核攻擊，釋放出2個H+，同時雙酚與銅離子形成分子軌道共面，研究已表明，分子軌道共面對于氧化還原反應的發生是必需的，生成復合物Emet-D并分解釋放出酪、水和還原態酶，完成循環雙酚在此循環中不斷被氧化成為醌，如圖所示。

3 結語

通過酶動力學手段，篩選酪氨酸酶高效的激活劑4-羥基苯乙酸，并總結出相關的構效關系，為進一步設計和改造得到新型高效的酪氨酸酶作用物奠定了基礎。