槲皮素對TGF—β誘導的人肺癌A549細胞上皮間質轉化的影響

[摘要] 目的 探討槲皮素對TGF-β誘導的人肺癌A549細胞上皮間質轉化的影響。 方法 在體外分別采取槲皮素及陰性對照DMSO干預經或不經TGF-β（10 ng/mL）誘導的人肺癌A549細胞12、24、48、72 h后，MTT法檢測不同濃度槲皮素對A549細胞增殖的影響；RT-PCR和Westem blot實驗檢測上皮間質轉化標志性因子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達變化。 結果 與陰性對照組相比，不同濃度槲皮素作用的實驗組A549細胞的增殖能力降低，同時在mRNA和蛋白水平E-cadherin上調以及N-cadherin、Vimentin的表達下調（P < 0.05）。 結論 槲皮素能夠抑制TGF-β 誘導的人肺癌A549細胞的增殖，且呈時間-劑量依賴性，阻止A549細胞發生上皮間質轉化，降低A549細胞的遷移侵襲運動能力。

[關鍵詞] 槲皮素；轉化生長因子β（TGF-β）；A549細胞；上皮間質轉化（EMT）

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）05-0006-03

肺腺癌是肺癌最常見的組織學類型，約占所有肺癌的50%，且70%～90%手術切除的肺腺癌為浸潤性腺癌[1]。肺腺癌的浸潤轉移是一個非常復雜的過程，涉及多種因素和多種機制。目前，上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肺腺癌浸潤轉移中的作用引起研究者的關注。EMT是腫瘤浸潤、轉移的一個非常重要的機制，與腫瘤后期的轉移和纖維化關系密切，研究EMT及其相關信號傳導通路可為控制肺癌的發生發展提供有效策略[2]。在EMT發生過程中，腫瘤組織中的上皮細胞標志物E-cadherin下調，間質細胞標記物N-cadherin和Vimentin上調。EMT的發生是一個復雜的過程，多種細胞因子和信號通路參與其調控[3]。其中，轉化生長因子β（TGF-β）是一個比較明確的可誘導上皮發生EMT 的重要誘導因子[4，5]。

槲皮素（Quercetin，Que）是黃酮類化合物重要的一員，屬于黃酮醇類化合物，在植物中多以糖苷的形式存在。槲皮素及其衍生物具有抗心律失常、抗血小板聚集、擴張血管、抗氧化、抗腫瘤等作用，因此槲皮素及其衍生物的合成和藥理活性研究受到越來越多人的關注，但其作用機制目前仍不清楚。本研究旨在通過觀察槲皮素對TGF-β誘導A549上皮細胞間質轉化（EMT）的影響，為開發新的抗肺癌藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肺腺癌細胞株 A549購自中科院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑及設備 H-DMEM培養基購自Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司；兔抗人E-cadherin單抗、兔抗人N-cadherin單抗、兔抗人Vimentin單抗購自Epitomics公司；兔抗人β-actin單抗購自北京中衫金橋公司；槲皮素（Quercetin）、TGF-β、四甲基偶氮唑鹽（MTT）和二甲亞楓（DMSO）均購自美國 Sigma 公司；Trizol、RT-PCR逆轉錄試劑盒、Premix Taq酶、DNA marker均購自TaKaRa公司；凱基全蛋白提取試劑盒購自凱基生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜、瓊脂糖（Agarose）、TAE（50×）均購自Beyotime（碧云天）公司；ECL發光試劑盒購自Millipore公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、構櫞酸鈉抗原修復液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 細胞培養 A549細胞用含10%胎牛血清（FBS）H-DMEM細胞培養基，在5%的CO2飽和濕度、37℃恒溫培養箱中常規培養。A549細胞呈單層貼壁生長，每2～3天換1次液，3～4 d傳代1次。A549細胞經過消化傳代，取對數生長期細胞待用。

1.2.2 藥物處理與分組 槲皮素用DMSO配成儲液后于-20℃冰箱保存。實驗時用H-DMEM培養基稀釋，DMSO的終濃度小于0.1%。實驗分3組，分別為TGF-β未干預組（A組）、溶劑對照組（B組）和實驗組（C組）。A組為H-DMEM+DMSO培養液，不含TGF-β，DMSO為等濃度溶劑；B組為H-DMEM培養+10 ng/mLTGF-β+DMSO，即槲皮素濃度為0；C組為H-DMEM培養液+10 ng/mL TGF-β+不同梯度濃度的槲皮素，槲皮素的終濃度分別為5、12.5、25、50、100、200 μmol/L。

1.2.3 MTT法檢測 取對數生長期的A549細胞懸液，以每孔3×103個細胞接種于96孔培養板，每孔加含10%FBS及TGF-β（10 ng/mL）H-DMEM培養液200 μL，于37℃、5% CO2培養箱培養8 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁后，按上述分組分別加入200 μL完全培養液（TGF-β未干預組）、含DMSO的培養液（溶劑對照組）以及含不同藥物濃度的培養液（實驗組）。繼續培養12、24、48、72 h，每濃度設5個復孔，于各時間段前4 h每孔避光加入MTT（5 g/L，PBS）20 μL，培養終止后棄上清加入DMSO 150 μL/孔，振蕩溶解10 min，待結晶完全溶解后于酶標儀570 nm處檢測各個濃度的吸光度值（A值），計算細胞的抑制率。細胞增殖抑制率（IR）=[（1-藥物處理組平均吸光度-溶劑對照組平均吸光度）/（對照組平均吸光度-溶劑對照組平均吸光度）]×100%。

1.2.4 RT-PCR檢測 采用Trizol一步法提取細胞藥物干預48 h后的總RNA，鑒定完RNA純度和完整性后，反轉錄制備cDNA，以cDNA為模板，在反應體系中加入目的基因和內參對照基因的引物（表1），設定反應參數，進行目的基因的擴增。PCR產物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統分析拍照并對凝膠條帶的信號強度進行半定量分析，以E-cadherin/β-actin、N-cadherin/β-actin、Vimentin/β-actin比值分別代表各自相對表達水平。2-ΔΔCT法計算E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA的相對表達量。每個實驗組重復3次。

1.2.5 Western blot檢測 分組收集用藥物干預A549細胞48 h后的細胞，加入適量細胞裂解液，冰浴30 min，高速離心后取上清采用BCA法測定蛋白濃度，調整到標準濃度后分別取50 μL樣品進行SDS-PAGE電泳，半干轉膜法轉至 PVDF膜。5%的脫脂奶粉封閉1 h，分別加一抗稀釋液（兔抗人單克隆抗體）4℃孵育過夜，再用辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗37℃孵育1 h。PBST 緩沖液洗膜10 min×3次。ECL熒光顯色后在暗室中進行X片曝光，結果用凝膠成像系統分析拍照并對凝膠條帶的信號強度進行半定量分析，以E-eadherin/β-actin、N-cadherin/β-actin、Vimentin/β-actin的比值作為各自蛋白的相對表達強度。

1.3 統計學處理

采用 SPSS13.0 統計軟件進行統計分析，計量數據以均數±標準差（x±s）表示，多組數據間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，各變量間關系采用直線相關分析。比較用t檢驗。P < 0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測槲皮素對TGF-β誘導下A549細胞增殖抑制的影響

MTT 結果顯示，不同濃度的槲皮素（Que）能抑制A549細胞增殖能力的上調。在12、24、48、72 h各組OD值見圖1。不同濃度的槲皮素對TGF-β誘導下A549細胞的生長均有抑制作用，隨著濃度的增加，抑制率呈明顯上升趨勢，顯示抑制作用呈劑量依賴關系，當槲皮素濃度大于50 μmol/L時，其對TGF-β誘導下A549細胞的增殖抑制明顯增強，但當濃度達200 μmol/L時，其增殖抑制率增強不明顯；槲皮素在對TGF-β誘導作用不同時間下 A549 細胞的生長抑制作用亦有不同，當槲皮素對A549 細胞作用48 h 和72 h 后，抑制率沒有明顯變化，但都高于24 h，可見，槲皮素作用A549 細胞 48 h 后，藥效基本達到最大，即存在時間依賴。

2.2 槲皮素對TGF-β誘導下A549細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表達的影響

槲皮素（Que）作用48 h，RT- PCR檢測其TGF-β誘導下A549細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA的相對表達變化（圖2）。與對照組相比較，實驗組的E-cadherin mRNA相對表達水平隨槲皮素作用濃度的增加而升高，而N-cadherinm RNA和Vimentin mRNA的表達隨槲皮素作用濃度的增加而降低；當槲皮素濃度大于25 μmol/L時，與對照組相比，三者表達變化均具有明顯差異（P < 0.05）。

2.3 槲皮素對TGF-β誘導下A549細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達的影響

將槲皮素（50 μmol/L）處理TGF-β誘導下A549細胞48 h后，Western blot測E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達變化。與對照組相比，E-cadherin蛋白表達下調，N-cadherin、Vimentin 蛋白表達上調，二者灰度值比較均具有統計學意義（P < 0.05）。見圖2。

3 討論

肺腺癌已嚴重威脅著人類的健康，由于其侵襲力強，往往發現病情即已轉移，手術、放化療是其治療的重要手段[6]，但其治療效果不理想，尋求一種低毒、高效的天然植物成分已成為抗腫瘤的希望。槲皮素作為一種具有潛在研究價值的中藥成分，由于其作用靶點多、自身不良反應少，在殺傷腫瘤細胞的同時有調節和提高機體免疫功能的多重功效。因此，其作為腫瘤治療藥物較其他化療藥物有很大優越性。

本實驗結果表明，不同濃度的槲皮素對人肺腺癌A549細胞的生長和增殖有明顯的抑制作用，并呈劑量-效應關系，且對EMT 標志性分子的影響具有顯著性差異（P < 0.05）。說明一定濃度的槲皮素可抑制TGF-β 誘導的人肺癌A549細胞的生長，阻止A549細胞發生上皮間質轉化，從而降低A549細胞的遷移侵襲運動能力。

腫瘤細胞的侵襲和轉移是惡性腫瘤的基本特征之一，上皮間質轉化在腫瘤細胞的侵襲轉移過程中的作用已成為近年來腫瘤研究的熱點。腫瘤細胞可通過EMT這個過程發生去分化獲得較強的侵襲轉移能力，從而導致纖維化紊亂，引起腫瘤發生[7，8]。在體外，腫瘤上皮細胞被TGF-β1誘導刺激經表型轉換成為纖維細胞，從而促使EMT發生，EMT同時賦予腫瘤細胞以侵襲遷徙和干細胞的特性，腫瘤侵潤免疫細胞（tumor-infiltrating immune cells）產生和分泌細胞因子TGF-β，可能通過參與 Wnt、Ras等干細胞傳導通路誘導EMT發生[9]。Mitsuo Sato等[10]近期闡述了肺癌發生EMT可能是一些原癌（如K-RAS）突變和腫瘤微環境（炎癥和缺氧）共同作用的結果，與非小細胞肺癌EMT相關的分子包括Epithelial cadherin、Vimentin、TGF-β、SLUG、SNAIL、TWIST、HIF-1α、miR-200c等。

中醫藥預防腫瘤的侵襲和轉移的研究正日益受到重視。槲皮素抗腫瘤作用機制正逐漸深入，但針對槲皮素對腫瘤EMT的作用研究少見報道[11]。我們的研究發現槲皮素能明顯抑制TGF-β誘導下人肺腺癌細胞A549的生長增殖能力，且可阻止其發生EMT推測槲皮素在腫瘤上皮細胞發生EMT的關鍵階段起重要作用，可能與腫瘤細胞的重編程有關，作用機制有待于進一步研究。

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（收稿日期：2012-12-13）