老年性白內障晶狀體上皮細胞凋亡及Fas、FasL表達的臨床意義

[摘要] 目的 探討老年性白內障晶狀體上皮細胞凋亡及Fas、FasL表達的臨床意義。 方法 采用免疫組化法檢測25例老年性白內障患者（觀察組）和10例成人尸體解剖非白內障眼球（對照組）的晶狀體前囊膜組織中Fas、FasL的表達，并應用TUNEL方法檢測兩組LECs的凋亡情況。 結果 觀察組LECs中凋亡細胞百分率為（30.4±3.7）%，對照組LECs中凋亡細胞百分率為（0.27±0.12）%。兩組凋亡細胞百分率比較，觀察組顯著高于對照組，差異有統計學意義（t=11.59，P<0.01）。觀察組LECs中Fas、FasL蛋白的陽性表達率為60.0%、68.0%，而對照組LECs中Fas、FasL蛋白的陽性表達率為10.0%、20.0%，兩組Fas、FasL蛋白陽性表達率比較，觀察組顯著高于對照組，差異有統計學意義（t=8.95，7.68，P<0.01）。25例老年性白內障患者的LECs中Fas、FasL蛋白的表達與細胞凋亡數間均呈正相關（r=0.574，0.614，P<0.01）。 結論 老年性白內障形成過程可能與LECs的凋亡及Fas、FasL的調控有關。

[關鍵詞] 細胞凋亡；Fas；FasL；晶狀體上皮細胞；老年性白內障

[中圖分類號] R776.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）03-

白內障發病機制十分復雜，其發生過程中最早發生的是晶狀體上皮的損害，且晶狀體上皮細胞凋亡是除先天性白內障以外的所有類型白內障形成的細胞學基礎。凋亡導致晶狀體上皮細胞密度降低，影響了晶狀體纖維生長及生長質量，上皮細胞缺損使其下的晶狀體纖維滲透壓平衡失去控制，使這部分晶狀體纖維的透明性和完整性受損。但晶狀體上皮細胞凋亡及其凋亡相關基因在白內障發生發展過程中的具體生物學機制尚不清楚。目前研究認為凋亡的基本分子框架是由細胞表面和細胞內受體及其相應配體的信號轉導所構成的復雜體系，其中促凋亡基因Fas與FasL的相互作用被認為參與多種細胞凋亡的發病機制[1-3]。本研究通過研究老年性白內障患者及正常人LECs的凋亡情況及相關調控基因Fas、FasL的表達，進一步探討細胞凋亡參與老年性白內障發生的作用機制，為開發在控制細胞凋亡水平上對白內障進行預防及藥物治療提供實驗依據和新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2007年9月～2012年2月筆者所在醫院眼科收治的老年性白內障患者25例為觀察組，其中男13例（13眼），女12例（12眼），年齡50～79歲，平均年齡（62.4±4.6）歲。所有患者均在常規白內障顯微手術術中采用連續環形撕囊，獲取其中央部的晶狀體前囊膜（直徑約5 mm）。另收集無白內障發生的成年人尸體解剖眼球的晶狀體前囊膜標本10例（標本來自暨南大學附屬第一醫院）為對照組。兩組取材標本均置入10%中性緩沖甲醛溶液中固定24～48 h，常規石蠟包埋，連續切片，厚度約3 μm。

1.2 主要試劑

EnVision試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Fas、FasL山羊抗人多克隆抗體（工作濃度1︰50）均購自美國PTG公司。TUNEL檢測細胞凋亡試劑盒購自Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 TUNEL方法檢測LECs的凋亡 切片常規脫蠟、水化、3%H2O2滅活處理、蛋白酶K消化，PBS液洗滌3次后加入TUNEL反應液（含TdT和Bio-21-dUTP），置37℃水浴箱1 h；終止后加入SA-AP反應液，置37℃水浴箱30 min；用DAB顯色，蘇木素襯染，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。用無DNA末端轉移酶的標記液代替TUNEL反應液設為陰性對照。結果判定：細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞，而正常細胞核被染為藍色。每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數100個細胞，計算凋亡細胞百分率：凋亡細胞與總細胞的比值即為上皮細胞凋亡率。

1.3.2 免疫組織化學染色 采用免疫組化EnVision法檢測兩組LECs中Fas、FasL的表達。操作程序按試劑盒說明書進行。PBS代替一抗為陰性對照，試劑盒提供的樣本片為陽性對照。染色結果判斷：LECs內見黃色或棕色顆粒為染色陽性。每張切片隨機選擇檢查5個視野，計數100個細胞，計數陽性細胞數，計算陽性細胞率。0%～5%為（-）；6%～25%為（+）；26%～50%為（++），>50%為（+++）。（+）～（+++）記為陽性。

1.4 統計學處理

應用SPSS13.0版統計軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗，指標之間的關系采用Spearson相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組LECs的凋亡情況比較

2.2 兩組LECs中Fas、FasL蛋白的表達比較

2.3 Fas、FasL表達與細胞凋亡數之間的關系

3 討論

Fas又稱為Apo-1或CD95，是屬于腫瘤壞死因子受體/神經生長因子受體（TNFR/NG-FR）家族的I型跨膜糖蛋白；FasL是Fas在體內的天然配體，屬于TNF家族的Ⅱ型膜蛋白。Fas與FasL以膜分子或可溶性分子形式存在于哺乳類機體細胞株表面，兩者在誘導細胞凋亡過程中的具有獨特作用：Fas起抑制作用，FasL則起促進作用，二者結合后，可以誘導Fas陽性細胞凋亡，這是誘導細胞凋亡的重要途徑之一。目前多數學者均認同Fas/FasL系統所誘導的細胞凋亡機制在機體與腫瘤細胞對抗中具有重要的生物學意義，而對Fas/FasL在白內障發生過程中的作用機制研究仍處于初步階段。國外Okamura N等[6]比較了年齡相關性白內障和糖尿病性白內障LEC的免疫組化及RT-PCR表明有增殖性視網膜病變的白內障組Fas及其mRNA的表達明顯增高。認為細胞凋亡在合并有增殖性視網膜病變的白內障組可能是通過Fas途徑介導的。國內尹莉莉等[7-8]研究發現Fas蛋白介導的LECs的凋亡在年齡相關性白內障及糖尿病性白內障的形成中起重要的作用。

本研究應用免疫組織化學法比較了對照組與老年性白內障組LECs中Fas、FasL的表達情況，證實老年性白內障患者LECs中Fas、FasL的陽性表達率均明顯高于正常人，且Fas、FasL在LECs中的表達與LECs凋亡百分率呈正相關（r=0.574，614，P<0.01）。提示老年性白內障形成過程可能與Fas、FasL的調控有關。推測這可能是正常人LECs中盡管也存在Fas與FasL的聯合表達，但并不能夠引發自身凋亡，LECs的凋亡可能需要足夠數量的FasL-Fas結合來提供凋亡刺激信號。LECs一旦受到其他損害刺激時，可激活FasL-Fas系統，大量FasL-Fas表達并結合，從而提供凋亡的刺激信號，最后導致LECs發生自身凋亡，伴隨出現的水電平衡失調及其他一些病理改變，最終形成白內障。相信隨著LECs凋亡及Fas、FasL表達調控機制逐漸被人們所認識，抑制Fas、FasL表達的相關分子生物學藥劑的研發，將為白內障的非手術治療以及藥物的開發提供新的思路。

[參考文獻]

[1] Yoon JH，Gores GJ.Death receptor-mediated apoptosis and the liver[J].Hepatol，2006，37（6）：400-408.

[2] Jeremians I，Kupatt C，Martin-Villalba A，et al.Involvement of CD95/Apol/Fas in cell death after myocardial ischemia[J].Circulation，2004，174（1）：71-78.

[3] Nogae S，Miyazaki M，Kobayashi N，et al.Induction of apoptosis in ischemia-reperfusion mode1 of mouse kidney：Possible involvement of Fas[J].Soc Nephrol，2006，58（6）：620-625.

[4] Huang XR，Qi MX，Wang ZY，et al.Inhibition effects of compound leech eye drops on apoptosis of lens epithelial cells and expressions of Bcl-2 and Bax genesin rats[J].Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao，2007，5（6）：681-685.

[5] 李桂榮，蘇冠方，周鴻雁.老年白內障晶狀體上皮細胞凋亡及凋亡基因的表達.中國老年學雜志，2007，27（12）：1186.

[6]Okamura N，Ho Y，Shibata MA，et al.Fas-mediated apoptosis in human lens epithellal cells of cataracts associated with diabetic retinopathy[J].Med Electron Mierosc，2002，35（4）：234.

[7] 尹莉莉，管懷進，胡紅莉，等.白內障手術摘出前囊下晶狀體上皮細胞中整聯蛋白、Fas蛋白的表達[J].眼外傷職業眼病雜志，2008，30（12）：918-920.

[8] 胡紅莉，尹莉莉，管懷進.白內障患者晶狀體上皮細胞中Fas蛋白的表達[J].國際眼科雜志，2008，8（2）：35-37.

（收稿日期：2012-11-26）

[基金項目] 廣東省東莞市醫療衛生一般科技項目（201210515011085）。