健脾解毒方對裸鼠人腸癌血管新生的抑制作用

[摘要] 目的 研究中藥復方健脾解毒方對裸鼠人腸癌血管新生的抑制作用。 方法 建立人腸癌COLO-205細胞裸鼠皮下移植瘤模型，隨機分為5組：模型組（生理鹽水組），健脾解毒方低、中、高劑量組[250、500、1000 mg/（kg·d）]和阿霉素組[1 mg/（kg·d）]。給藥第21天，各組均處死荷瘤鼠，測量腫瘤大小及質量。免疫組化法檢測瘤體的MVD和COX-2表達；ELISA測定血清中VEGF的表達。 結果 健脾解毒方低、中、高劑量組的瘤重抑制率分別為33.33%、36.54%、44.04%。免疫組化結果顯示，模型組、健脾解毒方低、中、高劑量組瘤體MVD計數分別為63.67±3.21、50.33±4.51、47.00±3.00、34.67±4.51，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.01）。ELISA結果顯示，健脾解毒方低、中、高劑量組血清VEGF表達與模型組相比顯著下調（P<0.01）。健脾解毒方能夠下調瘤體中COX-2蛋白表達，并且呈一定劑量依賴效應。 結論 健脾解毒方對人腸癌皮下移植瘤生長和血管新生具有一定抑制作用，其機制可能與下調COX-2和VEGF表達有關。

[關鍵詞] 健脾解毒方；結腸癌；血管新生；環氧化酶-2

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）03-

大腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率在我國乃至世界上呈逐年上升趨勢[1-2]。目前以手術治療為主，但復發轉移率高，其主要原因是腫瘤血管新生導致腫瘤向其他臟器組織侵襲、轉移。健脾解毒方由生黃芪、黨參、白術、薏苡仁、豬苓、石見穿、野葡萄藤、八月札組成。實驗研究表明，健脾解毒方能夠抑制腫瘤細胞生長、誘導細胞凋亡、抗侵襲轉移和逆轉多藥耐藥等作用[3-6]。為了進一步探討健脾解毒方對大腸癌的治療作用，本研究通過建立裸鼠人腸癌皮下移植瘤模型，研究健脾解毒方對大腸癌的血管新生的抑制作用。

1 材料

1.1 細胞系

人腸癌COLO-205細胞系購自上海博谷生物科技有限公司。

1.2 動物

BALB/c裸小鼠，體質量18～20 g，雄性，SPF級，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK（滬）2008-0016。

1.3 藥物

中藥復方健脾解毒方由上海中醫藥大學中藥學院制備[7]（批號：100702）；阿霉素購自Pfizer Italia S.r.l （批號：8NB002-A）；山羊抗小鼠CD34單克隆抗體（美國RD公司）；兔抗人COX-2單克隆抗體（美國CST公司）；VEGF ELISA試劑盒為上海博谷生物科技有限公司產品。

1.4 儀器

CKX41/U-RFLT50熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）；GalaxyS CO2培養箱（英國RS Biotech公司）；JY6001型天平（上海精科公司天平儀器廠）；5804R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 人腸癌細胞培養

人腸癌COLO-205細胞，用含10%的胎牛血清、1.5 g/L碳酸氫鈉、1.5 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培養液，置于體積分數5%CO2、飽和濕度、37℃孵箱中常規培養。

2.2 裸鼠人結腸癌移植瘤模型的建立及分組給藥

2.3 腫瘤體積、相對腫瘤體積、相對腫瘤增值率和腫瘤抑制率的計算

2.4 免疫組化Envision法檢測瘤體MVD的表達

組織塊用福爾馬林固定液固定，乙醇脫水至二甲苯透明，石蠟包埋，切片，抗原熱修復，封閉，一抗孵育，二抗孵育，DAB顯色，在顯微鏡下觀察染色程度，自來水充分沖洗終止反應；復染，脫水，透明，常規樹脂封片；每批染色均用已知的陽性切片做陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。按照Banerji S 等[11]的方法，即在低倍視野（×100）下掃描整個瘤體組織切片，選擇最密集的微血管標記區，低倍視野下確定微血管密集區后，然后在高倍鏡下（×200）選取3個不重復視野進行計數，求其平均數即作為該標本的MVD值。統計微血管的標準：CD34陽性染色定位于血管內皮細胞，呈棕黃或棕褐色，黏膜組織內孤立的棕黃色或棕褐色內皮細胞或內皮細胞簇均計數為一個血管，肌層較厚及管腔紅細胞數>8個的血管不被計數。

2.5 ELISA法檢測裸鼠血清中VEGF表達

將裸鼠進行摘除眼球取血，離心得到血清后進行ELISA實驗，測定血清中VEGF的表達情況。操作步驟按參照上海博谷生物科技有限公司提供的試劑盒說明書進行。將檢測結果用ELISA標準曲線專用軟件做出VEGF濃度的標準曲線，分別用標準曲線計算出各檢測孔中VEGF的濃度。

2.6 免疫組化染色方法檢測環氧化酶-2（Cyclooxygenase 2，COX-2）蛋白的表達

采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶（S-P）免疫組化染色法檢測COX-2蛋白的表達。以已知陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。計數采用雙盲法。采用圖像分析儀，結果判斷標準為在細胞出現棕黃色顆粒狀物為陽性標志。每張切片于高倍鏡下（×200）任選10個視野，細胞數>1000個以上，隨機觀察10個高倍視野，陽性計數采用雙盲法，以陽性率作為觀察指標。陽性表達率=表達陽性細胞數/總細胞數×100%。

2.7 統計學處理

3 結果

3.1 健脾解毒方對裸鼠人腸癌的生長抑制作用

3.3 健脾解毒方對裸鼠人腸癌VEGF表達的影響

健脾解毒方低、中、高劑量組均能下調裸鼠血清中VEGF表達水平，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.01），呈劑量依賴性。見表1。這表明，健脾解毒方能夠抑制裸鼠人腸癌VEGF表達。

3.4 健脾解毒方對裸鼠人腸癌COX-2蛋白表達的影響

4 討論

天然藥、傳統中藥有許多藥的活性成分具有抗腫瘤活性，在現代腫瘤治療中的作用日益受到重視，吸引了許多科研工作者對傳統中藥的抗腫瘤藥物結構功能、抗腫瘤機制進行深入細致的研究。抑制腫瘤血管新生已成為國內外研究的熱點，研究發現不少中藥或其有效成分是通過抑制血管新生發揮抗腫瘤作用的，如復方苦參注射液，丹參酮ⅡA，人參提取物人參皂苷Rg3等。本研究發現，健脾解毒方對人腸癌皮下移植瘤生長具有一定抑制作用，呈劑量依賴性；同時，健脾解毒方能夠抑制腫瘤MVD形成和下調促血管生成因子VEGF表達。

COX-2是催化花生四烯酸（Arachidonic Acid）產生前列腺素（Prostaglandins，PGs）的關鍵限速酶之一，被稱為“誘導型（inducible）”環氧合酶。COX-2屬誘導型，被認為是“快速反應基因”，在正常組織中無表達，當細胞受到各種刺激因素包括生長因子、細胞因子、炎性介質等作用時，COX-2的表達迅速上調，PGE2是COX-2催化花生四烯酸生成的主要產物[15]。現已證實COX-2的過度表達與結直腸癌的發生發展密切相關，其主要通過合成致癌物質、促進腫瘤血管新生、抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤粘附與轉移等多個環節促進腫瘤的發生發展。COX-2選擇性抑制劑在體內及體外均能發揮很好的抗腫瘤作用。Tsujii M等[16]發現轉染COX-2基因的CaCo-2結腸癌細胞株，在體外培養時產生的VEGF、Ang-2等血管生成因子量比未轉染的細胞株增加4-8倍，而COX-2抑制劑可使其恢復基礎水平。前期研究發現，COX-2/PGE2通過激活Wnt/β-catenin信號通路，上調VEGF表達，從而促進大腸癌血管新生[17]。本研究通過免疫組化檢測瘤體COX-2蛋白表達，結果發現，健脾解毒方能夠下調COX-2蛋白表達，這與前期研究發現健脾解毒方能夠抑制腫瘤血管新生和下調COX-2表達結果相一致[18-19]，說明健脾解毒方可能通過下調COX-2和VEGF表達抑制大腸癌血管新生。該實驗研究結果與Zhou LH等[13]丹參酮ⅡA可能通過COX-2途徑抑制C26結腸癌移植瘤模型MVD形成和下調血清中VEGF表達的觀點一致。

綜上所述，健脾解毒方能夠抑制人腸癌裸鼠皮下移植瘤的生長和MVD形成，其機制可能是通過調控COX-2表達抑制VEGF而發揮作用，詳細機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Ahmedin JD，Freddie Bray，Melissa M，et al.Global Cancer Statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[2] 王賽特.大腸癌已成為第二大常見腫瘤[N].解放日報，2008-4-22（13）.

[3] 吳瓊，王炎，周利紅，等.健脾解毒方治療裸鼠胃癌及其誘導胃癌細胞凋亡的研究[J].山西中醫學院學報，2010，11（3）：16-20.

[4] 劉寧寧，王炎，周利紅，等.健脾解毒方對幽門螺桿菌誘發胃癌血管新生的抑制研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（1）：88-92，95.

[5] 許建華，范忠澤，孫玨，等.腸胃清抗結腸癌轉移的機制研究[J].中國中醫藥科技，2006，13（3）：148-150.

[6] 李琦，隋華，劉宣，等.健脾解毒方介導JNK/SAPK信號通路調控人結腸癌細胞多藥耐藥.中華中醫藥雜志.2012，27（3）：731-735.

[7] 金旻逸，丁越，張彤，等.腸胃清顆粒提取工藝研究[J].亞太傳統醫藥，2011，7（2）：20-23.

[8] Yu SC，Chan CT.Transarterial ethanol of cirrhotic liver with lipiodol-ethanol mixture safety and efficacy study in rats[J].Invest Radiol，2006，41（8）：609-617.

[9] Minamimura T，Sato H，Kasaoka S，et a1. Tumor regression by inductive hyperthermia combined with hepatic embolization using dextran magnetite-incorporated microspheres in rats[J].Int J Oncol，2000，16（6）：1153-1158.

[10] Wu HP，Feng GS，Liang HM，et a1.Vascular endothelial growth factor antisense oligodeoxynucleotides with lipiodol in arterial embolization of liver cancer in rats[J].World J Gastroenterol，2004，10（6）：813-818.

[11] Banerji S，Ni J，Wang SX，et al.LYVE-1，a new homologue of the CD44 glycoprotein， is a lymph-specific receptor for hyaluronan[J].J Cell Biol，1999，144（4）：789-801.

[12] 李敏，錢曉萍，劉寶瑞.奧沙利鉑聯合復方苦參注射液抗血管生成作用的實驗研究[J].中國癌癥雜志，2008，18（3）：167-171.

[13] Zhou LH，Hu Q，Sui H，et al.Tanshinone II-A Inhibits Angiogenesis through Down Regulation of COX-2 in Human Colorectal Cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（9）：4453-4458.

[14] Xu TM，Xin Y，Cui MH，et al.Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 combined with cyclophosphamide on growth and angiogenesis of ovarian cancer[J].Chin Med J（Engl），2007，120（7）：584-588.

[15] Jia RP，Xu LW，Su Q，et al. Cyclooxygenase-2 expression is dependent upon epidermal growth factor receptor expression or activation in androgen independent prostate cancer[J].Asian J Androl，2008，10（5）：758-764.

[16] Tsujii M，Kawano S，Tsuji S，et al. Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells[J]. Cell，1998，93（5）：705-716.

[17] 劉宣，李丹光澤，周利紅，等.PGE2/COX-2激活Wnt/β-catenin信號通路調控人腸癌細胞VEGF表達[J].第二軍醫大學學報，2012，33（11）：1178-1181.

[18] 劉寧寧，王炎，吳瓊，等.健脾解毒方介導p38MAPK/ATF-2信號通路抑制幽門螺桿菌誘導的人胃癌細胞COX-2表達[J].中國中西醫結合雜志，2011，31（7）：926-931.

[19] 劉寧寧，周利紅，殷佩浩，等.健脾解毒方對幽門螺桿菌誘發胃癌過程微血管密度及環氧合酶表達的影響[J].中國中西醫結合雜志，2011，31（5）：647-652.

（收稿日期：2013-01-07）