微生物限度檢查法及其方法學驗證

摘要：本文從四個方面介紹2005版微生物限度檢查法增修訂內容，重點介紹細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證和控制菌檢查法的方法驗證，提請申報單位注意在后續品種的研發和申報過程中對所采用的微生物限度檢查法進行方法學驗證，以增加試驗方法的完整性、保證檢驗結果的可靠性。

關鍵詞：微生物限度檢查法方法學驗證

【中圖分類號】R-3【文獻標識碼】B【文章編號】1008-1879（2012）12-0395-01

微生物限度檢查法是檢查非規定滅菌制劑及其原、輔料受微生物污染程度的方法，檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查，與2000版相比，2005版微生物限度檢查法在以下幾方面進行了增修訂。

1標準的制訂原則

2000版微生物限度法標準細菌數、酵母菌數和霉菌數按劑型制訂，控制菌按給藥途徑制訂。由于同一劑型有不同的給藥途徑，且隨著新劑型的不斷出現，按劑型制訂標準具有局限性。2005版均按給藥途徑制訂，解決了這一局限性，不會因劑型的改變而帶來執行標準的混亂。

2標準的分類

分為三大類，即制劑通則項下規定；口服給藥制劑；局部給藥制劑，其中化學藥部分（二部）包括：①制劑通則、品種各論中要求無菌的制劑及標示無菌的制劑；②口服給藥制劑、局部給藥制劑：眼部給藥制劑；耳、鼻及呼吸道吸入給藥的制劑；陰道、尿道給藥制劑；直腸給藥制劑；其他局部給藥制劑。中藥部分（一部）包括：①制劑通則、品種各論中要求無菌的制劑及標示無菌的制劑；②口服給藥制劑：不含藥材原粉的制劑；含藥材原粉的制劑；含豆豉、神曲等發酵成分的制劑；③局部給藥制劑：用于表皮或黏膜不完整的含藥材原粉的局部給藥制劑；用于表皮或黏膜完整的含藥材原粉的局部給藥制劑；眼部給藥制劑；耳、鼻及呼吸道吸入給藥的制劑；陰道、尿道給藥制劑；直腸給藥制劑；其他局部給藥制劑。

3微生物限度檢查方法的增修訂

3.1明確了環境檢測執行的標準和方法，潔凈度要求及潔凈度定期檢查。

3.2檢驗量。隨機抽取不少于檢驗量（兩個以上最小包裝單位）的3倍；貴重、微量樣品檢驗量可酌減；要求檢查沙門菌的供試品其檢驗量應增加10g或10ml。

3.3供試液制備。表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物生長和存活無影響；供試液從制備至加入檢驗用培養基不得過1小時；供試液體積為100ml；非水溶性供試品：增加“十四烷酸異丙酯法”；結腸溶制劑的供試品：用pH為7.6無菌磷酸鹽緩沖液溶解；具抑菌活性的供試品：增加方法的可操作性。

3.4滅菌。培養基及稀釋劑采用驗證合格的滅菌程序進行滅菌。

3.5稀釋劑。增加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液、pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液。

3.6細菌、霉菌及酵母菌計數。

3.7控制菌檢查：新增大腸菌群檢查法、梭菌檢查法。

4微生物限度檢查法的驗證

微生物限度檢查法驗證的目的是確認所采用的方法是否適合于供試品的微生物限度檢查。驗證的內容包括準確性（回收率）、專屬性。驗證的類型分為前驗證（建立微生物限度檢查法時的驗證）和再驗證（修訂檢驗方法后、供試品組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時、定期的方法驗證），根據檢查方法的不同，又分為細菌、霉菌、酵母菌計數方法的驗證和控制菌檢查法的驗證。

4.1細菌、霉菌、酵母菌計數方法的驗證。驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率、驗證菌株為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草桿菌，菌種要求不得超過5代，菌液制備為50-100cfu/ml，驗證方法分試驗組、菌液組、稀釋劑對照組、供試品對照組。

4.2控制菌檢查法的驗證。試驗菌株按規定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株。大腸菌群檢查用大腸埃希菌；梭菌檢查用生孢梭菌，陰性對照菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌用大腸埃希菌；大腸埃希菌、沙門菌、大腸菌群用金黃色葡萄球菌。菌種的要求：不得超過5代，菌液制備為10～100cfu，驗證試驗按供試液的制備和控制菌檢查法的規定及下列要求進行.驗證試驗可與供試品的控制菌檢查同時進行。具體如下：

4.2.1試驗組。取規定量供試液及10～100cfu試驗菌加入增菌培養基中，依相應控制菌檢查法進行檢查，當采用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養基或取出濾膜接入增菌培養基中。

4.2.2陰性菌對照組。設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的特異性，方法同試驗組檢出。

4.2.3結果判斷。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌，若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查，試驗組未檢出試驗菌，應采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。

我們在審評工作中發現部分制劑本身具有抑菌或殺菌作用，如某些眼用軟膏劑，某些含生物堿的中藥復方制劑等，所制備的供試液本身具有影響微生物生長的作用，若不經方法學驗證，難以保證所采用方法的適合該供試品的微生物限度檢查，難以保證檢驗結果的準確、可靠及檢驗方法的完整性。

以上介紹2005版微生物限度檢查法增修訂內容，重點介紹細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證和控制菌檢查法的方法驗證，提請申報單位注意在后續品種的研發和申報過程中對所采用的微生物限度檢查法進行方法學驗證。