蒙藥冷蒿的遺傳多樣性隨機引物多態性分析

摘要：目的研究內蒙古通遼地區蒙藥冷蒿的遺傳特異性及通遼、呼和浩特、錫林郭勒3個不同地區蒙藥冷蒿的遺傳多樣性。方法采用隨機引物多態性(RAPD)方法，從17組RAPD引物中篩選出13組條帶清晰、多態性明顯并且重復性好的引物用于實驗，并利用Popgen32和NTSYS軟件進行數據計算與聚類分析。結果①13組引物共產生的209條帶中，有201條多態性帶，多態位點百分率達96.17%。② 3個地區蒙藥冷蒿Ht=0.238 1，Hs=0.187 4，Dst=0.050 7，地區間的Gst=0.212 9。③通過UPGMA分析，呼和浩特與錫林郭勒盟冷蒿聚為一類，通遼冷蒿單獨聚為一類。結論①冷蒿具有較高的遺傳多樣性且不同地區差異明顯。②冷蒿居群總的遺傳多樣性來自于居群內(78.71%)，且居群間有基因的交流。

關鍵詞：冷蒿種群 改進CTAB RAPD 遺傳多樣性

蒙藥冷蒿Atremisia frigida(蒙語：阿給)，又名小白蒿、菟毛蒿，菊科蒿屬的小灌木，是蒙醫的常用藥，主要分布在內蒙古[1～3]。近年來，隨著中藥材標準化進一步深入，為提高中藥質量和臨床效果，中藥材的道地性的研究越來越受到重視[4～6]。但對民族藥的道地性研究甚少。長期以來，蒙藥冷蒿一直在民間用于出血疾病的治療[7]。研究發現，不同產地來源的蒙藥冷蒿制炭后止血效果差異顯著，而且來自荒漠草原的蒙藥冷蒿制炭后活性成分的含量偏高。目前，冷蒿藥材來源為野生冷蒿，隨著荒漠化的進程，以及藥材的大量開采，將使冷蒿變成瀕危物種。為了避免野生藥用植物的枯竭，勢必要進行藥材的規范化栽培種植(GAP)，對冷蒿遺傳背景的分析，不但可以從遺傳學角度觀察引起冷蒿質量變異的原因，也可以為冷蒿栽培種植提供理論指導。

一、通遼居群內部遺傳多樣性分析本課題組采用通遼31株冷蒿樣本的DNA作為通遼地區冷蒿居群內RAPD擴增的樣本。

1. 居群內RAPD擴增帶的多態性分析13個引物在通遼31株冷蒿樣本中共擴增條帶數為209，多態性條帶數為180，多態位點比率為86.12%，平均每個引物擴增的DNA帶數為13.8條，位點分子量范圍均在200～2 000 bp之間。

2.居群內樣本的聚類分析遺傳相似度在0.22～0.76之間，其能夠在一定程度上反應個體間DNA的差異，根據相似度計算遺傳距離(本研究中各個體間遺傳距離未列出)，從而利用UPMGA法進行聚類分析，得到個體間親緣關系分枝樹系圖。

二、居群間遺傳多樣性分析呼和浩特、錫林郭勒冷蒿干藥材混合均勻，隨機取樣進行DNA的提取，選取DNA完整性好、含鹽量少，RAPD擴增結果穩定的3個不同批次的DNA樣本，代表其所在居群進行遺傳多樣性檢測和分析。鑒于居群遺傳多樣性指數與居群樣本數相關，隨機從通遼31個DNA樣本中選取5個樣本，進行居群間遺傳多樣性分析。通過對通遼居群5個樣本的Nei'' s指數、Shannon指數兩個準確反映遺傳多樣性的數據進行t檢驗，所得到的t值均小于2.78(df=4，α=0.05雙尾檢測)，說明隨機選取的樣本和總樣本無差異，能代表通遼地區的遺傳多樣性。

三、本實驗是在前人對不同地區冷蒿藥效差異分析的基礎上，利用RAPD，探究冷蒿的遺傳多樣性。根據鄒喻蘋等對165屬499種植物等位酶數據統計的結果，物種水平的多態性應在50%左右，居群水平的多樣性應為40%左右，Gst應在0.17左右。崔光紅等在藥用肉蓯蓉的遺傳多樣性RAPD分析中根據肉蓯蓉平均多態位點百分率47.37%，2個居群多態位點分別為39.47%，35.53%，Gst=0.2545，得出荒漠肉蓯蓉和管花肉蓯蓉的遺傳多樣性降低，已經處于極度低下狀態的結論。而本研究中物種水平的多態性在96.17%，居群水平所得多態性水平通遼(T)為76.08%、錫林郭勒(L)為52.63%、呼和浩特(H)為37.32%，Gst為0.212 9均高于這些平均值，所以，冷蒿在物種水平和居群水平上都有著豐富的遺傳多樣性。

冷蒿在北溫帶廣泛分布;多年生小半灌木;風媒異花受粉;存在于演替的各個階段。冷蒿有如此廣泛的分布，所面臨的環境差異大，個體和居群數目多，適應幅度大，基因交流頻繁，因此維持遺傳變異的能力強，產生新的遺傳變異的機會也多，這都有利于其增加遺傳多樣性水平，并使之保持較高的水平，高于高等植物平均遺傳多樣性水平(約70%)。 由于地理位置的不同，各種環境因子各有差異，這必然會影響不同地區居群的遺傳多樣性水平。用Nei'' s 指數、Shannon指數分析，通遼遺傳多樣性最豐富，錫林郭勒盟次之，呼和浩特最少。這與植株所在的環境有關。通遼地區41%的土地為沙沼，而且所用藥材新鮮，樣本量大，所以遺傳多樣性豐富。冷蒿作為一種風媒異花授粉的植物、在多水條件下不生存、在干燥的條件下，遺傳多樣性較豐富。錫林郭勒盟，常年大風，年均降雨少，因而遺傳多樣性豐富。呼和浩特地區因為降水量是3個地區中最高的，遺傳多樣性水平降低。

目前，藥材遺傳多樣性的研究多采用新鮮植株。但考慮到進行藥效分析和人們使用藥材時多用干藥材，因而本研究對呼和浩特和錫林郭勒兩個地區的干藥材進行遺傳多樣性分析。初步建立了較為合適的DNA提取、RAPD-PCR反應體系，并分析了3個地區冷蒿的遺傳多樣性水平，為進一步研究蒙藥冷蒿的藥效和遺傳多樣性的關系以及找到藥效差異的分子遺傳機制奠定基礎，從而為今后冷蒿栽培，品種改良提供正確的方向。

參考文獻:

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