牦牛皮蠅幼蟲的RFLP快速鑒定

摘要：從牦牛皮下采集皮蠅（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ）幼蟲，用ＤＮＡ提取試劑盒、Ｃｈｅｌｅｘ－１００兩種方法提取幼蟲的基因組ＤＮＡ；通過ＰＣＲ擴增線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ基因（ＣＯⅠ）中的高度可變序列，擴增產物經ＢｆａⅠ酶切后用瓊脂糖凝膠檢測，結果表明所采集的皮蠅幼蟲屬于同一種。測序結果顯示，擴增的序列與ＧｅｎＢａｎｋ中中華皮蠅（Ｈ. ｓｉｎｅｎｓｅ）相應序列的相似性為９９．５６％，表明所采集的皮蠅幼蟲均為中華皮蠅。

關鍵詞：牦牛；皮蠅（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ）幼蟲；ＲＦＬＰ；細胞色素氧化酶Ⅰ；鑒定

中圖分類號：Ｓ８５２．７４＋３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1477-04

ＲＦＬＰ Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉfiｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ Ｌａｒｖａ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｙａｋｓ

ＬＩＵ Ｈａｏ－ｈａｏ１，ＬＩ Ｙｕ－ｐｉｎｇ２，ＨＵＡＮＧ Ｚｈｉ－ｈｏｎｇ１，ＸＵ Ｙａ－ｏｕ１，ＪＩＮ Ｓｕ－ｙｕ１，ＬＩＮ Ｙａ－ｑｉｕ１， ＺＨＥＮＧ Ｙｕ－ｃａｉ１

（１.Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１，China；

２.Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｊｉｕｌｏｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ， Ｊｉｕｌｏｎｇ ６２２０００，Ｓｉｃｈｕａｎ，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＲＦＬＰ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｌａｒｖａｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｙａｋｓ． ＤＮＡ ｏｆ ｌａｒｖａｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ａｎｄ Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｏｘｉｄａｓｅ Ⅰ ｇｅｎｅ （ＣＯⅠ） ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ． ＢｆａⅠ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｌａｒｖａe ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ one ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｈａｒｅｄ ９９．５６％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ Ｈ． ｓｉｎｅｎｓｅ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｌａｒｖａｅ ｗｅｒｅ Ｈ． ｓｉｎｅｎｓｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｙａｋ； Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｌａｒｖａ； ＲＦＬＰ； ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｏｘｉｄａｓｅ Ⅰ； ｉｄｅｎｔｉｆication

牦牛皮蠅蛆病是牦牛中常見的一種寄生蟲病，該病發病率高，尤其是在１～２歲的幼齡牦牛中［１］。被皮蠅幼蟲感染的牦牛會出現產奶量下降、體重減少等癥狀，另外皮革的質量也會受損，這將嚴重影響藏區畜牧業的發展［２，３］。因此，加強該病的監測及防治工作非常重要。侵襲牦牛的皮蠅種類有很多，在我國主要有中華皮蠅（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｓｉｎｅｎｓｅ）、牛皮蠅（Ｈ． ｂｏｖｉｓ）、紋皮蠅（Ｈ． ｌｉｎｅａｔｕｍ）３種［１，２］，其中又以中華皮蠅最為常見。有資料統計，在藏區患皮蠅蛆病的牦牛中，大約有９０％是被中華皮蠅感染，剩余兩種皮蠅各占５％左右［４］。

皮蠅種類的鑒定方法已經有很多，最常見的是通過形態學特征與分子生物學特征鑒定。前者主要是用掃描電子顯微鏡觀察皮蠅３期幼蟲氣門板的形態以及體節腹面突棘的分布情況［１，２，５］，后者則是根據線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ（ＣＯⅠ）［１，４－７］、核糖體２８ Ｓ亞基［１］等基因的序列特征。雖然不同種類的皮蠅幼蟲形態有一些差異，但是形態學鑒定需要掃描電子顯微鏡等大型設備，操作不是很方便。本研究使用分子生物學方法，改良皮蠅幼蟲ＤＮＡ的提取方法，進行ＲＦＬＰ及測序分析鑒定采集到的牦牛皮蠅幼蟲，以期建立一種快速、可靠的牦牛皮蠅幼蟲鑒定方法。

１ 材料與方法

１．１ 樣品的采集

牦牛皮蠅幼蟲采自四川省九龍縣，在牦牛屠宰時采集４頭牦牛的皮下幼蟲（ｎ＝１１），迅速冰凍，送至實驗室后保存于－８０ ℃超低溫冰箱。

１．２ 主要儀器及試劑

主要儀器：電動勻漿器（瑞士Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ１２００Ｅ）、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ＥＰ梯度ＰＣＲ儀（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、Ｐｏｗｅｒ Ｐａｃ ３０００電泳儀（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ｖｅｒｓａ Ｄｏｃ １０００凝膠成像系統（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。主要試劑：ＴａＫａＲａ基因組ＤＮＡ提取試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）、２×Ｔａｑ Mａｓｔｅｒ Mｉｘ（天根生化科技（北京）有限公司）、Ｃｈｅｌｅｘ－１００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＢｆａⅠ（Ｆｅｒｍｅｎｔｓ）等，引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

１．３ 皮蠅幼蟲ＤＮＡ的提取

牦牛皮蠅２期或３期幼蟲稱重后，加入１０倍體積勻漿液（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ ８．０），用電動勻漿器在冰上勻漿，９ ３３０ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃離心２０ ｍｉｎ，上清液保存于－８０ ℃備用。

采用兩種方法提取牦牛皮蠅幼蟲ＤＮＡ。①取皮蠅幼蟲勻漿液２５０ μＬ，參照ＴａＫａＲａ基因組ＤＮＡ提取試劑盒從全血中提取ＤＮＡ的方法進行；②參照Ａｍｉｌｌｓ等［８］的Ｃｈｅｌｅｘ－１００方法，取幼蟲勻漿液２００ μＬ，用５０ ｇ／Ｌ的Ｃｈｅｌｅｘ－１００提取ＤＮＡ。提取的ＤＮＡ用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用核酸蛋白檢測儀測定其濃度。

１．４ 皮蠅幼蟲的分子生物學鑒定

使用Ｏｔｒａｎｔｏ等［７］設計的引物ＵＥＡ７（５′－ＴＡＣＡＧ

ＴＴＧＧＡＡＴＡＧＡＣＧＴＴＧＡＴＡＣ－３′）和ＵＥＡ１０（５′－ＴＣＣ

ＡＡＴＧＣＡＣＴＡＡＴＣＴＧＣＣＡＴＡＴＴＡ－３′）擴增皮蠅幼蟲細胞色素氧化酶Ⅰ基因（ＣＯⅠ）中編碼第四外環到羧基端（Ｅ４－ＣＯＯＨ）的片段。ＰＣＲ體系包括：２×Ｔａｑ Mａｓｔｅｒ Mｉｘ １２．５ μＬ，超純水８ μＬ，ＤＮＡ模板２．５ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ ＵＥＡ７和ＵＥＡ１０ 各１ μＬ。ＰＣＲ擴增程序為：９４ ℃ １２ ｍｉｎ；９４ ℃ １ ｍｉｎ，６０ ℃ １ ｍｉｎ，７２ ℃ １ ｍｉｎ，３８個循環；７２ ℃ ７ ｍｉｎ；１６ ℃保存［５］。擴增產物用１．５％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時選取１個ＰＣＲ產物直接進行雙向測序。

ＰＣＲ擴增產物用限制性內切酶ＢｆａⅠ酶切，反應體系包括ＰＣＲ產物２．５ μＬ，超純水１５ μＬ，Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，ＢｆａⅠ ０．５ μＬ。３７ ℃酶切１１ ｈ后用２．０％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

２ 結果與分析

２．１ 皮蠅幼蟲ＣＯⅠ基因的ＰＣＲ擴增結果

皮蠅幼蟲ＣＯⅠ基因編碼Ｅ４－ＣＯＯＨ片段的ＰＣＲ擴增結果見圖１。其中１～３號ＤＮＡ為試劑盒法提取，４～６號ＤＮＡ由Ｃｈｅｌｅｘ－１００法提取，二者擴增效果相同，均獲得了單一的、長約７００ ｂｐ的條帶。

２．２ 皮蠅幼蟲ＣＯⅠ基因ＰＣＲ產物酶切

皮蠅幼蟲ＣＯⅠ基因編碼E4-COOH片段的ＰＣＲ產物經ＢｆａⅠ酶切、電泳檢測顯示，所有個體均獲得了２條大小分別約為４２０ ｂｐ和２７０ ｂｐ的條帶（圖２），表明采集的皮蠅幼蟲均屬于同一種。

２．３ 皮蠅幼蟲ＣＯⅠ基因ＰＣＲ產物的測序及比對結果

選取１只皮蠅幼蟲ＣＯⅠ基因編碼E4-COOH片段的ＰＣＲ產物進行雙向測序，拼接后與ＧｅｎＢａｎｋ中中華皮蠅、牛皮蠅、紋皮蠅ＣＯⅠ基因中編碼Ｅ４－ＣＯＯＨ片段的序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號分別為：ＡＹ３５０７６９、ＡＦ４９７７６１、ＡＦ４９７７６２）進行比對（圖３）。結果發現該序列與中華皮蠅的相應序列只有３個堿基的差異，差異位點分別為６３、３３９、５４４，兩者序列一致性達到了９９．５６％；而與牛皮蠅、紋皮蠅則分別有６０個、４７個堿基的差異，相應的序列一致性分別為９１．２８％、９３．１７％，表明本試驗所采集的牦牛皮蠅幼蟲均為中華皮蠅。

３ 討論

有報道顯示，在青藏高原牧區患皮蠅蛆病的牦牛中，大約有９０％是由于中華皮蠅的感染［４］。本研究根據皮蠅幼蟲ＣＯⅠ基因中編碼Ｅ４－ＣＯＯＨ片段的ＲＦＬＰ分析以及序列比對結果，并參考Ｏｔｒａｎｔｏ等［１］的研究結果，證實所采集的牦牛皮蠅幼蟲均為中華皮蠅，與之前的報道相符［４，９］。用分子生物學方法鑒定牦牛皮蠅種類的相關研究已有不少報道［１，４－７，９］，該法在其他動物的皮蠅幼蟲鑒定中也獲得了可靠的結果［１０－１２］。與形態學方法相比，分子生物學方法結果準確可靠，操作也較簡單，同時不需要大型儀器設備，應用前景廣闊。

本研究在皮蠅幼蟲ＤＮＡ的提取過程中采用Ｃｈｅｌｅｘ－１００方法，取得了很好的效果。該方法提取的ＤＮＡ用作ＰＣＲ模板時，與試劑盒提取ＤＮＡ的效果相差不大，但該法操作簡單、成本低、污染小，尤其適合高通量的ＤＮＡ提取。這為今后牦牛皮蠅幼蟲的大規模鑒定提供了可靠、有效的方法。

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