魚腥藍細菌PCC 7120中兩個磷酸酶Ｎ端結構域活性分析

摘要：為了研究魚腥藍細菌（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．）ＰＣＣ ７１２０中兩個ＰＰ２Ｃ類蛋白磷酸酶ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２的磷酸酶活性，將編碼兩個蛋白Ｎ端至跨膜區的基因片段重組到質粒中，轉化大腸桿菌進行原核表達，獲得了可溶性的ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白。并且以ｐＮＰＰ為底物測定了所得蛋白的磷酸酶活性，雙倒數作圖法結果顯示ＰｒｐＪ１ｕｐ蛋白的Ｋｍ為０．３０ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ為７．１０ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ；ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白的Ｋｍ為０．２４ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ為０．４３ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ。

關鍵詞：魚腥藍細菌（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．）；ＰｒｐＪ１；ＰｒｐＪ２；N端結構域；磷酸酶活性

中圖分類號：Ｑ９３３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1474-03

Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ－ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｔｗｏ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ． ＰＣＣ ７１２０

ＸＵ Ｘｉｎｇ－ｊｉａｎ，ＣＨＥＮ Ｗｅｎ－ｌｉ，ＷＡＮＧ Ｌｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇy／Ｓｔａtｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｎ－ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｗｏ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＰｒｐＪ１ ａｎｄ ＰｒｐＪ２ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ２８ａ． Ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎs ＰｒｐＪ１ｕｐ ａｎｄ ＰｒｐＪ２ｕｐ were ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｎｉ－ＮＴＡ ａｒｇｒｏｓｅ． Ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｏｆ ＰｒｐＪ１ｕｐ ａｎｄ ＰｒｐJ２ｕｐ ｔｏｗａｒｄｓ ｐＮＰＰ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｋｍ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｏｆ ＰｒｐＪ１ｕｐ were ０．３０ ｍｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ ７．１０ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； While Ｋｍ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｏｆ ＰｒｐＪ２ｕｐ were ０．２４ ｍｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ ０．４３ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ respectively．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ． ＰＣＣ ７１２０； ＰｒｐＪ１； ＰｒｐＪ２； N-domain； ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ

魚腥藍細菌（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．） ＰＣＣ ７１２０是一種絲狀的革蘭氏陰性細菌，能夠進行光合作用，屬光能自養型細菌［１］。當環境中缺乏化合態氮源時，魚腥藍細菌ＰＣＣ ７１２０菌絲上有５％～１０％的細胞會分化成異形胞［２，３］，專一地執行生物固氮功能。在魚腥藍細菌ＰＣＣ ７１２０中有兩個同源性很高的基因ｐｒｐＪ１（ａｌｌ１７３１）和ｐｒｐＪ２（ａｌｌ２７４０），它們的氨基酸序列具有５７％的相似性和４０％的一致性，在催化結構域區一致性更是達到４５％。這兩個基因的編碼產物均為ＰＰ２Ｃ類蛋白磷酸酶，蛋白質Ｎ端結構域為酶的活性中心，Ｃ端為未知功能結構域，中間有一個疏水跨膜區，使蛋白定位在質膜上［4］。ｐｒｐＪ１基因參與魚腥藍細菌ＰＣＣ ７１２０異形胞一種特異性糖脂的合成［5］，該基因的缺失會導致異形胞發育不完全，容易脫落，從而使魚腥藍細菌ＰＣＣ ７１２０在缺氮后不能生長。而當ｐｒｐＪ１和ｐｒｐＪ２同時缺失時，魚腥藍細菌ＰＣＣ ７１２０則完全喪失了發育異形胞的功能，而且調節異形胞發育的兩個關鍵基因ｈｅｔＲ和ｎｔｃＡ的上調表達都受到了抑制。由此推測PｒｐＪ２與PｒｐＪ１很可能位于同一調控途徑中，在異形胞發育早期共同發揮著重要作用［6，7］，但其作用機制目前并不清楚。對PｒｐＪ２與PｒｐＪ１的功能進行研究，確定其底物或互作蛋白將有助于揭示其參與異形胞發育調控的機制，進一步完善異形胞發育的調控網絡。由于ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２都是跨膜蛋白，原核表達純化效果較差，存在較多的雜蛋白［８，９］，影響了對其的體外研究。本研究分別將兩個基因編碼跨膜區及Ｃ端結構域的片段截除，再進行原核表達，獲得包含Ｎ端結構域和活性中心的截短蛋白ｐｒｐＪ１ｕｐ和ｐｒｐＪ２ｕｐ（圖１），避免了蛋白跨膜區對蛋白純化的影響，并且分析了所獲得蛋白的磷酸酶活性，以期為進一步研究兩個蛋白在異形胞生長發育中的作用和機制奠定基礎。

１ 材料與方法

１．１ 質粒、菌株

質粒ｐＥＴ２８ａ，大腸桿菌ＴＧ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）及魚腥藍細菌（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．）ＰＣＣ ７１２０均為華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室藍細菌室保存。

１．２ 表達載體的構建

本研究所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物ＰｒｐＪ１ｕｐＮｆ（５′－ＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧ

ＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＡＡ－３′）和ＰｒｐＪ１ｕｐＮｒ（５′－ＣＧＣ

ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＡＴＴ－３′）用于擴增ｐｒｐＪ１基因５′端１ ７４９ ｂｐ的片段；引物ＰｒｐＪ２ｕｐＮｆ（５′－ＣＴＴＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＧＡＡＣＧＧＡ

ＴＡＡＴ－３′）和ＰｒｐＪ２ｕｐＮｒ（５′－ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＧＧ

ＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＴ－３′）用于擴增ｐｒｐＪ２基因５′端

１ ７９４ ｂｐ的片段。

以魚腥藍細菌ＰＣＣ ７１２０總ＤＮＡ為模板進行目的基因片段的擴增，反應體系如下：ＤＮＡ模板０．５ μＬ，上下游引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各２ μＬ，ＫＯＤ Ｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ）１ μＬ，ＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ＭｇＳＯ４ ５ μＬ，ｄＮＴＰｓ ２ μＬ，用去離子水補足至５０ μＬ。ＰＣＲ擴增程序為：９４ ℃預變性３ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，退火３０ ｓ，６８ ℃延伸９０ ｓ，３０個循環；６８ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ產物用０．８％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增得到的ｐｒｐＪ１基因片段與ｐＥＴ２８ａ質粒用ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ雙酶切，乙醇沉淀后用Ｔ４連接酶酶連，得到重組質粒ｐＥＴ２８ａ－ＰｒｐＪ１ｕｐ；將擴增得到的ｐｒｐＪ２基因片段插入到ｐＥＴ２８ａ的ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ位點，得到重組質粒ｐＥＴ２８ａ－ＰｒｐＪ２ｕｐ，將重組質粒進行酶切驗證并測序。

１．３ 蛋白的誘導表達及純化

將所得的重組質粒轉化到大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，挑取單克隆接種到５ ｍＬ含有５０ ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＬＢ培養基中過夜培養，次日以１∶１００的比例接種到含有５０ ｍｇ／Ｌ卡那霉素的１００ ｍＬ ＬＢ培養基中，３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培養至A６００ ｎｍ為０．６左右時，加入終濃度為０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，２８ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ誘導培養６ ｈ左右，離心收集菌體，使用ＰＢＳ緩沖液重懸細胞，加入終濃度為１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＭＳＦ，使用壓力破碎儀進行細胞破碎，離心取上清，使用鎳離子親和層析柱進行蛋白純化。收集不同濃度咪唑（４０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００ ｍｍｏｌ／Ｌ）洗脫液，進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測。

１．４ 磷酸酶的活性檢測

使用磷酸酶的通用底物對硝基苯酚磷酸二鈉（ｐＮＰＰ）對純化后的蛋白進行磷酸酶活性測定。反應緩沖液為１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ ８．５，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２，１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ和５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ［１０］。本研究使用的ｐＮＰＰ濃度梯度分別為０．１０、０．２５、０．５０、０．７５、１．００、２．５０、５．００ ｍｍｏｌ／Ｌ，２ ｍＬ反應體系加入２ μｇ蛋白，３０ ℃反應３０ ｍｉｎ。反應完成后，測定４００ ｎｍ處的吸光度A400 nm。根據對硝基苯酚的摩爾吸光系數１６ ５００ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）計算對硝基苯酚的濃度，然后用雙倒數作圖法分別計算ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ的Ｋｍ與Ｖｍａｘ。

２ 結果與分析

２．１ 質粒構建結果

以魚腥藍細菌ＰＣＣ ７１２０總ＤＮＡ作為模板，以ＰｒｐＪ１ｕｐＮｆ、ＰｒｐＪ１ｕｐＮｒ為引物進行ＰＣＲ擴增，將得到的擴增片段插入到ｐＥＴ２８ａ質粒載體的ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ位點，得到重組質粒ｐＥＴ２８ａ－ＰｒｐＪ１ｕｐ。將重組質粒用ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ進行酶切驗證可以得到預期的５ ３６９ ｂｐ的載體片段和１ ７４９ ｂｐ的ｐｒｐＪ１基因片段。采用類似的方法，以ＰｒｐＪ２ｕｐＮｆ、ＰｒｐＪ２ｕｐＮｒ為引物進行ＰＣＲ擴增，將得到的擴增片段插入到ｐＥＴ２８ａ質粒載體的ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ位點，得到重組質粒ｐＥＴ２８ａ－ＰｒｐＪ２ｕｐ。利用ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ進行酶切驗證也可得到預期的５ ３６９ ｂｐ的載體片段和１ ７９４ ｂｐ的ｐｒｐＪ２基因片段。將經過酶切驗證的重組質粒進一步進行序列分析檢測（圖２），結果表明已經獲得正確的ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ的重組質粒。

２．２ 蛋白表達純化結果

將獲得的重組表達質粒轉入大腸桿菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）中進行誘導表達，ＩＰＴＧ終濃度為０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ，２８ ℃誘導６ ｈ，ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白可以被大量誘導表達，而且兩種蛋白均主要以可溶的形式存在。收集誘導后的菌體，細胞破碎后使用鎳離子親和層析柱進行純化，將不同濃度的咪唑洗脫液進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，結果顯示濃度為１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ和２００ ｍｍｏｌ／Ｌ的咪唑洗脫液中可以獲得很好的純化蛋白（圖３）。ＰｒｐＪ１ｕｐ分子量約為６４ ｋｕ，ＰｒｐＪ２ｕｐ分子量約為６５ ｋｕ，可以看出所獲得的純化蛋白大小與預期相符，應為目的蛋白。

２．３ 磷酸酶活性測定結果

對硝基苯酚磷酸二鈉（ｐＮＰＰ）是磷酸酶活性測定的通用底物，其磷酸化狀態下水溶液為無色透明的，經磷酸酶脫去磷酸后生成對硝基苯酚（ｐＮＰ），變為黃色，并且在４００ ｎｍ處有吸收峰，吸光系數為１６ ５００ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ），測定Ａ４００ ｎｍ可以計算ｐＮＰ的濃度。采用雙倒數作圖法計算ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白對ｐＮＰＰ的Ｋｍ和Ｖｍａｘ（圖４），結果顯示ＰｒｐＪ１ｕｐ蛋白的Ｋｍ為０．３０ ｍｍｏl／Ｌ，Ｖｍａｘ為７．１０ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ；ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白的Ｋｍ為０．２４ ｍｍｏl／Ｌ，Ｖｍａｘ為０．４３ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ。

３ 小結與討論

魚腥藍細菌（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．）ＰＣＣ ７１２０是研究絲狀藍細菌異形胞發育及細胞間信號交流的模式生物［10，11］。ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２蛋白均為ＰＰ２Ｃ類蛋白磷酸酶，并且共同參與異形胞發育早期的調控［１２，１３］，確定其底物將有助于進一步揭示ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２參與異形胞發育調控的機制。體外研究ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２的功能及確定其底物需要以純化的蛋白為基礎，但ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２都是定位在質膜上的蛋白，跨膜區的存在將影響蛋白的純化效果。本研究表達了ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２蛋白跨膜區上游片段ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ，避免了跨膜區對蛋白純化的影響，獲得了更易純化的蛋白。磷酸酶活性檢測顯示ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ蛋白都具有較高的磷酸酶活性，表明ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２蛋白的疏水跨膜區及Ｃ端結構域對其磷酸酶活性可能不是必需的，ＰｒｐＪ１ｕｐ和ＰｒｐＪ２ｕｐ可以替代其全蛋白進行體外實驗。本研究為體外尋找ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２的底物及互作蛋白，并進一步研究ＰｒｐＪ１和ＰｒｐＪ２在異形胞調控網絡中的作用奠定了基礎。

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