薄荷組織培養(yǎng)條件的選擇

摘要：考察了消毒方式、外植體部位、培養(yǎng)基配方等因素對薄荷（Ｍｅｎｔｈａ ｈａｐｌｏｃａｌｙｘ Ｂｒｉｐ．）組織培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，外植體先用體積分?jǐn)?shù)７０％的乙醇處理３０ ｓ后，再用１ ｍｇ／Ｌ ＨｇＣｌ２+2滴吐溫８０浸泡一定時(shí)間，消毒效果好于40 ｍｇ／Ｌ的漂白粉處理，適宜的ＨｇＣｌ２消毒時(shí)間分別為莖段、葉片、葉柄和已萌發(fā)的芽１２ ｍｉｎ；末萌發(fā)的芽１０ ｍｉｎ。莖段的不定芽誘導(dǎo)率和不定芽生長情況好于其他外植體。在薄荷旺盛生長期采集半木質(zhì)化的莖段作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，不定芽萌芽早而且生長速度快。ＭＳ＋０．５0 ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．１0 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ是適合外植體不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方。

關(guān)鍵詞：薄荷（Ｍｅｎｔｈａ ｈａｐｌｏｃａｌｙｘ Ｂｒｉｐ．）；外植體；組織培養(yǎng)

中圖分類號：Ｓ５６７．２３＋５；Ｑ８１３．１＋２ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1471-03

The Ｏｐｔｉｍｉｚation of Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｎｔ Ｅｘｐｌａｎｔｓ

ＭＡ Ｔｏｎｇ－ｆｕ１，２，CAI Jian1

（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｕｙａｎｇ Ｔｅａｃｈｅｒｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｆｕｙａｎｇ ２３６０３７，Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ａｎｔｉａｇｉｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｅｒｂ，Ｆｕｙａｎｇ ２３６０３７，Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ， ｅｘｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ， ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒｍｕｌａ ｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｍｉｎｔ（Ｍｅｎｔｈａ ｈａｐｌｏｃａｌｙｘ Ｂｒｉｐ．） ｗａｓ ｓｔｕｄiｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｂｅｉｎｇ ｉｍｍｅｒｓｅｄ ｉｎ ７０％ ｅｔｈａｎｏｌ， 1 mg/L ＨｇＣｌ２＋Tｗｅｅｎ ８０ ｈａｄ ｂｅｔｔｅｒ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｔｈａｎ 40 mg/L ｂｌｅａｃｈｉｎｇ ｐｏｗｅｒ． Ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ ｏｆ ＨｇＣｌ２ for ｓｔｅａｍ， ｌｅａｆ， ｌｅａｆｓｔａｌｋ and ｇｅｍｉｎａｔｅｄ ｂｕｓ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ １２ ｍｉｎ； 10 min for sｔｅａｍ， ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｓｔｅａｍ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｖｉｇｏｒｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｍｉｎｔ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｒａｔｅ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｅｘｐｌａｎｔｓ． ＭＳ＋０．５0 ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．１0 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ ｗａｓ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ buds induction of ｍｉｎｔ explants．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｉｎｔ（Ｍｅｎｔｈａ ｈａｐｌｏｃａｌｙｘ Ｂｒｉｐ．）； ｅｘｐｌａｎｔ； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ

薄荷（Ｍｅｎｔｈａ ｈａｐｌｏｃａｌｙｘ Ｂｒｉｐ．）為唇形科草本植物，中醫(yī)學(xué)上以薄荷全草入藥，其性涼、味辛，具有疏散風(fēng)熱、清利頭目、理氣解郁之功效，主治外感發(fā)熱、風(fēng)濕初起、頭痛目赤、咽喉腫痛、皮膚癮疹等癥［１，２］。國內(nèi)外有關(guān)薄荷離體培養(yǎng)的研究主要注重組織培養(yǎng)、微繁殖和原生質(zhì)體培養(yǎng)等［３－７］。雖然任何器官、任何組織、單個(gè)細(xì)胞和原生質(zhì)體都可以作為外植體［８，９］，但實(shí)際上，不同外植體的分化能力有很大差異，培養(yǎng)的難易程度不同［１０，１１］。為保證植物組織培養(yǎng)獲得成功，選擇合適的外植體是非常重要的［１２－１４］。本試驗(yàn)以薄荷頂芽、腋芽、葉片、莖段、葉柄為外植體，研究不同外植體及培養(yǎng)條件對薄荷組織培養(yǎng)的影響。

１ 材料與方法

１．１ 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)于２０１０年３月至２０１１年２月在阜陽師范學(xué)院生物技術(shù)應(yīng)用研究所生物組培室進(jìn)行。試驗(yàn)材料為阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的薄荷品系阜油９號。

１．２ 試驗(yàn)方法

１．２．１ 外植體的采集 2010年６月在田間選取健壯、生長勢強(qiáng)、氣味濃郁的植株作為處理材料。取薄荷新生枝的中部葉片，去除葉片部分后即得所需葉柄。腋芽消毒后剝?nèi)パ亏[，剝?nèi)。浮保?ｍｍ長的芽尖。芽用刀片從莖稈上切下。

１．２．２ 外植體的消毒 外植體采集后先用流水沖洗１０ ｍｉｎ，其中莖段需要用刷子刷洗幾遍，然后用７０％的乙醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）處理外植體３０ ｓ，再分別用1 mg/L ＨｇＣｌ２＋２滴吐溫８０或40 mg/L的漂白粉對外植體消毒（表１）。消毒后均用無菌水沖洗４～５遍。

每次消毒４０個(gè)外植體，分成２個(gè)瓶消毒，消毒后在超凈臺上剝?nèi)ネ馊~后接種。對葉片進(jìn)行消毒時(shí)，先消毒復(fù)葉，后切下小葉和葉柄，每次消毒２～３個(gè)復(fù)葉。已萌發(fā)的芽先切成０．５ ｃｍ長的小段再進(jìn)行消毒。各外植體接種后，每周觀察外植體的形態(tài)變化，３０ ｄ后統(tǒng)計(jì)各消毒處理的污染率、死亡率、成活率。

污染率＝污染的外植體個(gè)數(shù)／接種個(gè)數(shù)×１００％；

死亡率＝褐變死亡但沒有被污染的外植體個(gè)數(shù)／外植體接種個(gè)數(shù)×１００％；

成活率＝成活且未被污染的外植體個(gè)數(shù)／外植體接種個(gè)數(shù)×１００％

１．２．３ 不同外植體對不定芽誘導(dǎo)的影響 分別以待萌發(fā)的飽滿腋芽、莖段、頂芽為外植體，按１．２．２所得的最佳消毒方法處理，將外植體接種在ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．２５ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３的培養(yǎng)基上。每種外植體每瓶接種３個(gè)，接種１０瓶，重復(fù)２次。接種１５ ｄ后統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率和成活率。

從芽的初發(fā)期至芽的生長期（２０１０年３～９月），每隔２０ ｄ采集莖段１次，莖段消毒后，接種在ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ＋０．２５ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３培養(yǎng)基上，每次接種３０個(gè)外植體，培養(yǎng)期間每周觀察外植體的形態(tài)變化，接種３０ ｄ后統(tǒng)計(jì)不定芽的污染率、死亡率和成活率。

１．２．４ 培養(yǎng)基組分對不定芽誘導(dǎo)的影響 ①基本培養(yǎng)基。分別以ＭＳ、１／２ＭＳ、Ｂ５為基本培養(yǎng)基，均加入１．０ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．２５ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)３．０％的蔗糖和０．６５％的瓊脂，調(diào)整ｐＨ為５．８～６．０，于１２１ ℃高溫高壓滅菌２０ ｍｉｎ。在滅菌后的培養(yǎng)基中接入帶１個(gè)芽的薄荷莖段光照培養(yǎng)，光照度為１ ０００ ｌｘ，光照時(shí)間為１４ ｈ／ｄ，培養(yǎng)溫度為２５ ℃。每處理接種６０個(gè)外植體，重復(fù)３次。②激素濃度。２０１０年８月采集薄荷葉片、葉柄、莖段，先用７０％的乙醇消毒３０ ｓ，再用1 ｍｇ／Ｌ ＨｇＣｌ２＋2滴吐溫８０消毒２０ ｍｉｎ后，莖段切成０．５ ｃｍ長的小段，葉片切成０．５ ｃｍ×０．５ ｃｍ的小塊，接種到ＭＳ培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基分別添加Ａ． ０．０５ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．０１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ；Ｂ． ０．１0 ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．０１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ；Ｃ． ０．５ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．１0 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ；Ｄ． １．０0 ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．１0 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ。每處理１０瓶，每瓶接種５個(gè)外植體，重復(fù)２次。培養(yǎng)期間每７ ｄ觀察記錄外植體的形態(tài)變化，３０ ｄ后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 消毒方式對薄荷外植體組織培養(yǎng)的影響

表１顯示的是以莖段和芽為外植體，消毒方式對組織培養(yǎng)效果的影響。可以看出，外植體的污染率隨消毒時(shí)間的延長而降低。由于莖段表面密被星狀毛，不利于滅菌，所以污染表現(xiàn)較早，一般在７～１０ ｄ左右。葉柄傷口處常有白色膿狀分泌物流出，為細(xì)菌污染，少有真菌污染，這與葉腋處消毒不徹底有關(guān)。以比較幼嫩的組織為外植體，消毒時(shí)間對其死亡率的影響較大，因此在選擇適宜的消毒時(shí)間時(shí)，除了考慮污染率外，還要參考死亡率。總的看來，各外植體用７０％的乙醇處理３０ ｓ后用1 ｍｇ／Ｌ ＨｇＣｌ２＋２滴吐溫８０浸泡消毒效果較好，適宜的消毒時(shí)間分別為：莖段、葉片、葉柄和已萌發(fā)的芽１２ ｍｉｎ；末萌發(fā)的芽１０ ｍｉｎ。

２．２ 不同外植體的不定芽誘導(dǎo)效果

將消毒處理后的幼葉、葉柄接種在不同的培養(yǎng)基上，７ ｄ后幼葉的主脈最先長出不定芽，繼而切口處逐漸愈傷化，不定芽自兩端形成，并向中間發(fā)展，直至整個(gè)組織；２０ ｄ后，不定芽已覆蓋整個(gè)葉片；葉柄在接種１５ ｄ后，其一端開始出現(xiàn)黃綠色緊密的不定芽，有的葉柄兩端出現(xiàn)不定芽，但其不定芽的增殖較慢。

頂芽、腋芽、莖段３種外植體不定芽的萌發(fā)生長情況見表２。由表２可知，就３種外植體的不定芽誘導(dǎo)時(shí)間而言，莖段所需時(shí)間最短，接種后７ ｄ即可萌發(fā)；腋芽所需時(shí)間最長，為１０ ｄ。從誘導(dǎo)率來看，莖段的誘導(dǎo)率最高，為８０％，頂芽的誘導(dǎo)率最低，僅為５４％。從不定芽的生長情況來看，莖段不定芽的高度最高，為１．２ ｃｍ，腋芽不定芽生長情況最差，高度僅為０．２ cｍ。可見以莖段為外植體，不定芽誘導(dǎo)效果最好。

２．３ 莖段采集時(shí)期對組織培養(yǎng)效果的影響

由于在生長期間莖段的木質(zhì)化程度不一樣，莖上腋芽的生長狀態(tài)也不同，不同時(shí)期采集的樣品，其萌芽時(shí)間、污染率、成活率存在很大差異。由表３可知，３月１２日、６月１６日和８月３１日采集的薄荷莖段成活率均高于５０％，分別為６１％、５６％和５２％，污染率分別為３０％、４４％和４２％。就不定芽萌發(fā)時(shí)間而言，以３月１２日采集的莖段所需的時(shí)間最長，培養(yǎng)后３０ ｄ才萌發(fā)。３月和１０月采集的為剛萌發(fā)的芽或飽滿的休眠態(tài)的莖段，雖能抽枝展葉，但所需時(shí)間較長，且芽生長速度慢。而４～８月薄荷正處于生長旺盛期，莖段呈半木質(zhì)化，只需１０ ｄ左右不定芽即可萌發(fā)生長，１個(gè)月后即可用于繼代培養(yǎng)，獲得無菌苗。所以，生長旺盛期（４～８月）是較適宜的莖段采樣時(shí)間，不僅成活率較高，而且不定芽萌發(fā)較快。

２．４ 基本培養(yǎng)基對莖段組織培養(yǎng)的影響

分別以ＭＳ、１／２ＭＳ和Ｂ５ ３種培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，接入消毒處理后的薄荷莖段外植體，１個(gè)月后不定芽的生長情況見表４。由表４可知，以ＭＳ為基本培養(yǎng)基，不定芽的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到８０％，不定芽的平均高度為１．０ ｃｍ。以Ｂ５或１／２ＭＳ為基本培養(yǎng)基，不定芽的誘導(dǎo)和生長情況相差不大。

２．５ 培養(yǎng)基中激素濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響

以葉片、葉柄和莖段為外植體，在ＭＳ基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的ＢＡ和ＮＡＡ，不定芽的誘導(dǎo)率都在７２％以上（表５），ＭＳ＋０．５0 ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．１0 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ培養(yǎng)基中幼葉、葉柄和莖段３種外植體的不定芽誘導(dǎo)率均高于８０％，分別為１００％、８８％和８７％，而且不定芽的長勢也最好，培養(yǎng)１個(gè)月左右高度即能達(dá)到１．０ ｃｍ，其中幼葉的不定芽最高可達(dá)１．５ ｃｍ。ＭＳ＋１．０0 ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．１0 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果次之，ＭＳ＋０．０５ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．０１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最差。

３ 小結(jié)與討論

影響薄荷組織培養(yǎng)的因素很多，本研究考察了消毒方式、外植體部位、培養(yǎng)基配方等因素對不定芽誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，外植體先用７０％的乙醇處理３０ ｓ后，再用1 ｍｇ／Ｌ ＨｇＣｌ２+2滴吐溫８０浸泡一定時(shí)間，消毒效果較好。不同外植體適宜的消毒時(shí)間不同，幼嫩組織的消毒時(shí)間不宜過長，否則會降低其成活率。

外植體的選擇對不定芽的誘導(dǎo)有很大影響，不同外植體不定芽的誘導(dǎo)率和成活率有較大差異。選擇適宜的外植體，可有效提高組織培養(yǎng)效率，快速獲得無菌苗。頂芽、莖尖、新生枝的污染率低，但由于材料幼嫩，對消毒液敏感，成活率比較低。腋芽在切下時(shí)葉原基易受破壞，所以不定芽誘導(dǎo)率和生長情況都較差。莖段在不同季節(jié)生長狀態(tài)不同，在休眠期莖段完全木質(zhì)化，可能帶內(nèi)生菌比較多，而且外植體一般較粗，影響滅菌的效果，所以其容易受污染。在生長旺盛期，莖段為半木質(zhì)化狀態(tài)，能自然地抵抗細(xì)菌的侵入，因此所含內(nèi)生菌較少，表面消毒后誘導(dǎo)培養(yǎng)污染率降低，成活率升高，有利于薄荷的快速繁殖。此外，在薄荷生長旺盛期采集半木質(zhì)化的莖段作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，還具有不定芽萌芽早、生長速度快的優(yōu)勢。ＭＳ＋０．５0 ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．１0 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ是適合外植體不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方，葉片、葉柄和莖段的不定芽誘導(dǎo)率均高于８０％。

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