中壓制備與大孔樹脂聯用快速分離羥基紅花黃色素A

摘要：用水超聲法提取紅花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．）中紅花黃色素Ａ，提取液經Ｄ－１０１大孔吸附樹脂色譜柱進行粗分，所得水及體積分數３０％的乙醇洗脫物用中壓制備色譜進行兩次分離純化，所得產物經高效液相色譜分析，羥基紅花黃色素Ａ純度為９５．９６８％。該方法省時、簡便、高效，值得推廣應用。

關鍵詞：紅花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．）；中壓制備色譜；大孔吸附樹脂；羥基紅花黃色素Ａ

中圖分類號：Ｒ２８４．２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1441-03

Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｘｙｓａｆｆｌｏｒ Ｙｅｌlｏｗ Ａ ｆｒｏｍ Ｓａｆｆｌｏｗｅｒ ｂｙ Ｍｅｄｉｕｍ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ｒｅｓｉｎ

ＷＵ Ｙｏｎｇ－ｇａｎｇ，ＬＩ Ｘｕｅ－ｙｉｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ， Ｍｅｓｓａｇｅ， Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｙａｎｔａｉ ２６４１99， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｈｙｄｒｏｘｙｓａｆｆｌｏｒ ｙｅｌlｏｗ Ａ （ＨＳＹＡ） ｃｒａｆｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｗａｔｅｒ－ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｒｏｍ ｓａｆｆｌｏｗｅｒ （Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．） ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｐｅｒａｔｅｄ ｂｙ D-101 macroporous resin ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ３０％ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ medium pressure column chromatograph ｆｏｒ ｔｗｉｃｅ. Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＨＰＬＣ ｒｅｓｕｌｔｓ， ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ＨＳＹＡ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｐ ｔｏ ９５．９８６％． Tｈｉｓ ｍｅｃｈｏｄ ｗａｓ ｔｉｍｅ ｓａｖｉｎｇ， ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ， ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｂｌｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： sａｆｆｌｏｗｅｒ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．）； ｍｅｄｉｕｍ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ； ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ； ｈｙｄｒｏｘｙｓａｆｆｌｏｒ ｙｅｌlｏｗ Ａ（ＨＳＹＡ）

紅花為菊科植物紅花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．）的干燥管狀花，為活血化瘀的主要中藥之一，用于治療冠心病、腦血栓等心腦血管疾病［１，２］。紅花的主要活性成分是紅花黃色素（Ｓａｆｆｌｏｗｅｒ ｙｅｌｌｏｗ，ＳＹ），其是一種復雜的水溶性混合物，其結構中含有特殊的醌式查爾酮的結構骨架，一直是紅花化學成分研究的重點［３］。ＳＹ中含量較高的是羥基紅花黃色素Ａ（Ｈｙｄｒｏｘｙｓａｆｆｌｏｒ ｙｅｌlｏｗ Ａ，ＨＳＹＡ），占ＳＹ的５０％左右。ＨＳＹＡ是具有單查爾酮苷類結構的化合物，被認為是紅花活血化瘀的主要效應物質［４，５］。目前分離制備ＨＳＹＡ通常采用大孔吸附樹脂色譜法對紅花提取物進行除雜后得ＨＳＹＡ粗品，Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０凝膠柱層析法制備ＨＳＹＡ純品［６，７］，但這些方法不適用于快速、大規模制備ＨＳＹＡ。中壓制備色譜是一種快速制備色譜系統，具有上樣量大、分離速度快、可梯度洗脫、成本低、在線檢測等優勢［８］，本研究采用水提取和大孔吸附樹脂柱色譜得到粗提物，以此粗提物直接進行中壓制備色譜分離純化，經兩步分離得到純度高于９５％的ＨＳＹＡ，豐富了ＨＳＹＡ的制備技術。

１ 儀器與材料

ＥＺ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＩＩＩ中壓制備色譜系統及Ｖｅｒｓａｔｉｌｅｒ色譜工作站（配有二元溶劑輸送泵、ＵＶ檢測器、自動餾分收集器，上海利穗電子科技有限公司）。色譜柱及填料：Ｃ１８－ＡＱ（ＧＨＯＤＳＢ１２Ｓ５０，５０ μｍ，北京綠百草科技發展有限公司），４ ｃｍ×１４ ｃｍ（４０ ｇ），２根串聯。Ａｇｉｌｅｎｔ １２００型高效液相色譜儀，包括Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ１３１２Ｂ二元泵，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ１３７９Ｂ脫氣機，Ａｇｉｌｅｎｔ １３１３Ｂ自動進樣器，Ａｇｉｌｅｎｔ １３１６Ｂ柱溫箱，Ａｇｉｌｅｎｔ １３１５Ｂ二極管陣列檢測器、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔａｔｉｏｎ化學工作站。

乙腈（ＨＰＬＣ級，德國Ｍｅｒｃｋ公司）、三氟乙酸（分析純，南開大學精細化學實驗廠）、甲醇（色譜純，天津市大茂化學試劑廠）、純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司，使用前經０．４５μｍ水系濾膜過濾）、Ｄ－１０１大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）、羥基紅花黃色素Ａ對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號１１１６３７－２００３０１）；紅花為菊科植物紅花（Ｃ． ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ．）的干燥管狀花。

２ 試驗方法與結果

２．１ 水超聲法提取ＨＳＹＡ

２．１．１ 高效液相色譜分析條件［９－１１］ 色譜柱：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）；流動相：乙腈（Ａ）－０．０１％三氟乙酸溶液（Ｂ）；洗脫程序：０～５ ｍｉｎ：２％Ａ（體積分數，下同）；５～２５ ｍｉｎ：２％～５％Ａ；２５～３５ ｍｉｎ：５％～１０％Ａ；３５～６５ ｍｉｎ：１０％～２０％Ａ；６５～７０ ｍｉｎ：２０％Ａ。柱溫：３０ ℃；流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；檢測波長：２８０ ｎｍ；進樣體積：２０ μＬ。

２．１．２ 標準曲線的繪制 精確稱取羥基紅花黃色素Ａ對照品１５．００ ｍｇ置２５ ｍＬ容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，得０．６０ ｍｇ／ｍＬ羥基紅花黃色素Ａ對照品儲備液，配制成一定濃度梯度的對照品溶液，按2．1．１所述條件進行色譜分析，以Ｙ表示峰面積積分值，以Ｘ（ｍｇ）表示對照品進樣量，繪制標準曲線，并計算回歸方程。其線性回歸方程為Ｙ＝２６ ８０５．００Ｘ－２９８．３６，Ｒ２＝０．９９９ １。

２．１．３ 紅花水提取液制備 稱取紅花藥材９００ ｇ，加１５倍質量的蒸餾水超聲提取２次，每次４５ ｍｉｎ，過濾，合并濾液減壓濃縮至９００ ｍＬ（此時提取液含生藥的濃度為１ ｇ／ｍＬ）。加入９５％的乙醇（體積分數，下同）使含醇量達到８０％，醇沉２４ ｈ，濾液減壓回收至９００ ｍＬ，加５倍體積的蒸餾水沉淀２４ ｈ，離心，上清液減壓濃縮至９００ ｍＬ，備用。

２．２ 大孔吸附樹脂柱色譜法制備粗品ＨＳＹＡ

取上述紅花水提液９００ ｍＬ上直徑４０ ｍｍ×８００ ｍｍ的Ｄ－１０１大孔吸附樹脂色譜柱，蒸餾水洗脫的前３個體積洗脫液（３ ＢＶ）中主要是多糖、蛋白質、鞣質等水溶性雜質，棄去，然后依次用蒸餾水、３０％的乙醇、６０％的乙醇、９５％的乙醇各３ ＢＶ洗脫，流速為１ ｍＬ／ｍｉｎ，１ ＢＶ收集洗脫液約７５０ ｍＬ，共收集１２份。

采用ＨＰＬＣ法測定每份洗脫液中ＨＳＹＡ的含量，繪制相應的洗脫曲線（圖１）。根據洗脫曲線，合并含量高于０．０４ ｍｇ／ｍＬ的第１～４份洗脫液，第５~12份洗脫液由于ＨＳＹＡ相對含量較少而放棄。減壓濃縮后得浸膏１８．０ ｇ，冰箱中冷凍保存，備用。

２．３ 中壓制備色譜分離

為降低試驗成本，本試驗首先采用甲醇－水體系進行各組分分離。精確稱取浸膏樣品２．０ ｇ用１０ ｍＬ甲醇溶解，經０．４５ μｍ微孔濾膜過濾，注入ＯＤＳ柱中。洗脫條件為柱溫：室溫；波長：２８０ ｎｍ；流速：２０ ｍＬ／ｍｉｎ；線性梯度洗脫程序：在６０ ｍｉｎ內，甲醇與水的體積比由０∶１００變化為５０∶５０，中壓系統分析色譜如圖２，根據色譜峰情況收集洗脫液，進行ＨＰＬＣ分析。結果發現峰Ａ中ＨＳＹＡ含量較高，對其減壓濃縮進行二次中壓制備。線性梯度洗脫程序：在28 ｍｉｎ內，乙腈與水的體積比由０∶１００變化為３０∶７０，中壓系統分析色譜如圖３，根據出峰情況精確收集。

２．４ 產物的純度分析

ＨＰＬＣ分析各洗脫液并與標準品對照，結果表明峰Ｂ為ＨＳＹＡ，其ＨＰＬＣ圖譜上僅一峰（圖４），由面積歸一化法算得其純度為９５．９６８％，減壓濃縮后真空干燥得１３７ ｍｇ ＨＳＹＡ黃色粉末。

３ 小結與討論

１）大孔樹脂是一類有機高聚物吸附劑，注有致孔劑，不含交換基團，含有“空隙”結構，特別適合從水溶液中分離化合物［１２，１３］。本試驗用大孔樹脂法制備的紅花粗提液采用水和乙醇洗脫效果較好。

２）采用中壓制備色譜對紅花大孔樹脂粗提液進行分離純化，單位時間獲得的化合物量大，４ ｈ即可完成整個分離過程。分離效果好，避免了ＨＳＹＡ在開口柱上由于長時間暴露而導致分解；柱填料可以自行填裝，根據所制備的ＨＳＹＡ極性較大的特點，選擇Ｃ１８反相填料純化；同時２根色譜柱串聯可有效提高分辨率，本試驗連續兩次對紅花粗提液中壓色譜分離制備，第一次通過中壓柱層析分段，然后再次分離制備，取得了不錯的效果。在中壓制備色譜分離過程中，要注意以下幾個問題［５］：①化合物要溶解于系統溶劑。②化合物與固定相不存在不可逆吸附。③選擇適宜的洗脫方式和流動相比例。本研究中，先后選擇典型溶劑系統甲醇／水和乙腈／水進行線性梯度洗脫，連續兩次分離制備，從盡可能低的濃度開始梯度洗脫以確保不丟失目標物質。

３）本試驗采用大孔樹脂柱色譜與中壓制備色譜法結合，從紅花中直接分離得到高純度（９５．９６８％）的ＨＳＹＡ。該方法簡便、快速。從２．０ ｇ粗提物中得到１３７ ｍｇ ＨＳＹＡ。值得注意的是，水洗脫除雜時應注意在除去糖類的同時應盡可能保留較多的ＨＳＹＡ，至于如何提高分離純化效率，還有待進一步研究。

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