超聲波法提取黃皮葉中黃酮工藝的優化

摘要：使用超聲波法提取黃皮（Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ）葉中的黃酮，并用單因素試驗和正交設計優化提取工藝。結果顯示與浸提法相比，超聲波法能提高黃酮的提取率、縮短處理時間。橄欖黃皮葉中黃酮的提取率高于雞心黃皮和黑皮黃皮。優化的黃皮葉黃酮提取條件為乙醇體積分數８０％、提取溫度４０ ℃、超聲處理時間４０ ｍｉｎ、料液比１∶６０（m∶V，g/mL），此條件下黃皮葉中黃酮提取率為３．６２％。

關鍵詞：黃皮（Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ）葉；黃酮；超聲波法；提取

中圖分類號：Ｒ２８４．２；Ｓ６６６．６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1433-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ Method ｏｆ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｆｒｏｍ Ｌｅａｆ of Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ

ＺＨＯＵ Ｙａｎ－ｆａｎｇ

（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｐａｒｍｅｎｔ， Ｈａｎｓｈａｎ Ｔｅａｃｈｅｒｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｃｈａｏｚｈｏｕ ５２１０４１， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｆｒｏｍ ｌｅａｆ ｏｆ Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ， ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｒａｆｔ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｌｉｘｉｖｉａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ， ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ-ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｓｈｏｒｔｅｒ． Ｔｈｅ Ｃ． ｌａｎｓｉｕｍ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｗｉｔｈ ｏｌｉｖｅ ｌｅａｆ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｙｉｅｌｄ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｔｅｓｔｅｄ ｃｕｌｔｉｖａｒs． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ， ｔｈｅ optimum ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｏｆ Ｃ． ｌａｎｓｉｕｍ ｗａｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｖｏｌｕｍｅ fraction ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ， ８０％； Eｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ４０ ℃； Uｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ， ４０ ｍｉｎ； Sｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， １∶６０（m∶V，g/mL）； Aｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ was ３．６２％ under this condition．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｅａｆ ｏｆ Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ； ｆｌａｖｏｎｏｉｄ； ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

黃皮（Ｃｌａｕｓｅｎａ ｌａｎｓｉｕｍ）是蕓香科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）黃皮屬植物，產于我國南部，如福建、廣東、臺灣、廣西、云南等地［１］。民間常將其與所用部位合稱，如黃皮果、黃皮核、黃皮子、黃皮葉等。黃皮葉性味屬辛、苦、平，《本草求原》中記載黃皮葉有“解穢除垢，退黃腫”之功用。民間用其葉煮水洗浴治療疥癩、消風腫等。已報道的黃皮化學成分有香豆素類、卡巴唑和酰胺生物堿類、揮發油及萜類、糖分、有機酸、果膠、維生素Ｃ、黃酮堿等。天然來源的生物黃酮分子小，能被人體迅速吸收，通過血腦屏障進入脂肪組織，進而表現出消除疲勞、保護血管、防動脈硬化、擴張毛細血管、疏通微循環、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大腦及其他臟器細胞的功能［2］。研究表明，黃皮葉中的黃酮具有顯著抑菌效果，且抗過敏活性高，在食品防腐、水果保鮮、醫藥等領域具有廣闊的應用前景［3，4］。本試驗從３個黃皮品種的葉中進行黃酮的提取及初步鑒別，以期為黃皮葉的藥用價值及其在食品加工中的開發利用提供科學根據。

１ 材料與方法

１．１ 材料與儀器

７２２Ｓ型分光光度計、ＫＱ５００ＤＢ型數控超聲波清洗器等；蕓香葉苷為生物純，其他試劑均為分析純；雞心黃皮、橄欖黃皮、黑皮黃皮老葉均于２０１１年３月１０日采摘于廣東省潮州市潮安縣西坑村。

１．２ 試驗方法

１．２．１ 蘆丁標準溶液的配制和標準曲線的繪制 按照文獻［5］的方法進行蘆丁標準溶液的配制和標準曲線的繪制（圖１），得到蘆丁濃度Ｘ（Ｃ//ｍｇ/ｍＬ）對吸光度Ｙ（Ａ５１０ ｎｍ）的回歸方程為Ｙ＝１５．６０７ 0Ｘ－０．１５６ ９，Ｒ２＝０．９９７ ７。

１．２．２ 黃皮葉中黃酮的提取 以雞心、黑皮和橄欖３個品種黃皮葉干燥粉末為原料，分別用浸提法和超聲波提取法提取黃酮，提取溶劑為體積分數２０％、４０％、６０％、８０％的乙醇，料液比為１∶１０（ｍ∶Ｖ，ｇ／ｍＬ，下同），浸提溫度和時間分別為浸泡提取：室溫、２４ ｈ；超聲波提取：４０ ℃、３０ ｍｉｎ。測定所得提取液中黃酮的含量，比較兩種方法所得黃酮提取率。

１．２．３ 單因素試驗 根據１．２．２的試驗結果，以黃酮提取率最高的品種為原料，設置單因素試驗分別考察超聲波法的提取溫度、超聲處理時間和料液比對黃酮提取率的影響。①提取溫度。提取條件為料液比１∶１０，超聲處理時間２０ ｍｉｎ，體積分數８０％的乙醇為提取溶劑，提取溫度分別為３０、４０、５０、６０、７０ ℃。②超聲處理時間。提取溫度５０ ℃，料液比１∶１０，體積分數８０％的乙醇為提取溶劑，超聲處理時間分別為１０、２０、３０、４０、５０ ｍｉｎ。③料液比。超聲處理時間２０ ｍｉｎ，體積分數８０％的乙醇為提取溶劑，提取溫度為５０ ℃，料液比分別為１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０。

１．２．４ 正交試驗 對影響黃皮葉中黃酮提取的關鍵因素乙醇體積分數、提取溫度、超聲處理時間、料液比進行４因素３水平正交試驗，因素與水平見表１。

２ 結果與分析

２．１ 浸提法與超聲波提取法的比較

用浸提法和超聲波法提取３個品種黃皮葉中黃酮，所得結果見表２。由表２可知其他條件相同時，同一黃皮品種中超聲波法所得黃酮的提取率高于浸提法，且處理時間大大縮短。相同條件下橄欖黃皮的黃酮提取率比雞心黃皮和黑皮黃皮的黃酮提取率高，因此后期試驗均以橄欖黃皮為材料。

由表２還可看出，隨著提取溶劑乙醇體積分數的增加，黃酮的提取率也不斷升高，試驗條件下以體積分數８０％的乙醇為提取劑所得黃酮提取率最高。乙醇體積分數過高，黃皮葉中脂溶性物質的溶出也增加，會給后期的提純帶來困難，因此確定以體積分數８０％的乙醇為提取劑［6］。

２．２ 單因素試驗結果

２．２．１ 提取溫度對黃皮葉中黃酮提取率的影響 黃皮葉中黃酮的提取率隨著提取溫度的升高而逐漸升高（圖２），這主要是由于溫度升高，溶劑分子的運動比較活躍，對黃酮的提取有利，當溫度高于５０ ℃時，溶劑的揮發速度也隨著加快，提取率隨溫度升高而升高的幅度很小［7］，故提取溫度以５０ ℃為宜。

２．２．２ 超聲處理時間對黃皮葉中黃酮提取率的影響 黃酮的提取率先隨著超聲處理時間的延長而升高，在超聲處理時間為３０ ｍｉｎ時達到最高，之后隨超聲處理時間的延長反而下降（圖３）。分析其原因，可能是３０ ｍｉｎ時黃皮葉中的黃酮已經充分溶出，此后再延長處理時間，會導致溶液中的黃酮降解，從而降低了提取率［8］。

２．２．３ 料液比對黃皮葉中黃酮提取率的影響 在試驗范圍內，黃酮的提取率隨著料液比減小而升高（圖４），可見提取溶劑用量增加，可使更多的黃酮溶于溶液中，但提取劑用量也不宜過高，否則會導致產物中雜質增多，并給后期產物的收集和純化帶來不便［9］。

２．３ 正交試驗結果

由表３可知，各因素對黃皮葉中黃酮提取效果影響的大小順序是乙醇體積分數、料液比、超聲處理時間、提取溫度。黃皮葉黃酮的最佳提取條件為Ａ１Ｂ３Ｃ３Ｄ３，即提取溫度４０ ℃、超聲處理時間４０ ｍｉｎ、體積分數８０％的乙醇為提取劑、料液比為１∶６０，在此條件下黃酮的提取率為３．６２％，高于其他試驗組合。

２．４ 回收率試驗結果

采用加標回收法［10］，取３份最優條件下的提取液各１ ｍＬ，分別置于２５ ｍＬ的比色管中，再分別加入０．２、０．３、０．４ ｍＬ濃度為０．２ ｍｇ／ｍＬ的蘆丁標準液，測定Ａ５１０ ｎｍ，計算總黃酮含量，結果見表４。樣品的平均回收率為９９．８４％，ＲＳＤ為３．５２％，表明本法具有良好的回收率。

３ 結論

１）與傳統醇提取法相比，超聲波提取法大大縮短了提取時間，且黃酮的提取率也有所提高。

２）橄欖黃皮葉中黃酮的含量高于雞心黃皮和黑皮黃皮葉中黃酮的含量。

３）根據單因素試驗和正交試驗結果，各因素對橄欖黃皮葉中黃酮提取效果影響的大小順序是：乙醇體積分數、料液比、超聲處理時間、提取溫度。橄欖黃皮葉中黃酮的最佳提取條件為提取溫度４０ ℃、超聲處理時間４０ ｍｉｎ、體積分數為８０％的乙醇做提取溶劑、料液比為１∶６０。

４）加標回收法測定結果表明，試驗具有良好的回收率，黃酮的平均回收率為９９．８４％。

參考文獻：

［１］ 趙 青，李創軍，楊敬芝，等． 黃皮葉的化學成分研究［Ｊ］． 中國中藥雜志，２０１０（８）：９９７－１０００．

［2］ 陳 化，吳迎椿． 超聲波提取小葉榕總黃酮及鑒別［Ｊ］． 時珍國醫國藥，２００８，１９（７）：１６７７－１６７８．

［３］ 趙豐麗，楊健秀，梁燕美，等． 黃皮葉乙醇提取物化學成分預實驗及對植物病原菌的抑制作用［Ｊ］． 食品科技，２００９（１）：１９５－１９９．

［4］ 趙豐麗，李潔榮，楊健秀． 黃皮葉不同溶劑提取物抗過敏活性研究［Ｊ］． 食品工業科技，２００９（１）：１１０－１１２．

［６］ 徐愛列，馮 瑛，周建青，等． 海娜中黃酮類化合物的提取及含量測定［Ｊ］． 安徽農業科學，２００７，３５（１１）：３２５０－３２５１．

［７］ 程海燕，戚向陽，李培培，等． 超聲波輔助提取楊梅果實中黃酮類化合物的工藝研究［Ｊ］． 現代食品科技，２００９（９）：１０６６－１０６９．

［８］ 丁利君，周圳輝，林燕如． 芒萁中黃酮物質的提取及其抗氧化研究［Ｊ］． 食品科學，２００５，２６（８）：７７－８２．

［９］ 邵 紅，邊才苗，楊蓓芬，等．香菜總黃酮的超聲提取工藝研究［Ｊ］． 食品研究與開發，２００６，２６（５）：８９－９１．

［１０］ 鄧 斌，王存嫦，劉志偉，等． 超聲波提取紫花苜蓿中黃酮類化合物的工藝研究［Ｊ］． 江蘇農業科學，２００９（１）：２５７－２５８．