以魯西黃牛為受體的高產奶牛胚胎移植研究

摘要：以自然發情的魯西黃牛為受體，移植經性控技術生產的高產奶牛７日齡雌性冷凍胚胎，共移植合格受體牛５ ５１６頭，移植后６０～８０ ｄ進行直腸孕檢，懷孕２ ２２８頭，移植準胎率為４０．３９％；共繁殖奶牛犢牛１ ３４６頭，其中母牛１ ２７９頭，公牛６７頭，胚胎性別控制率為９５．０２％。左側與右側卵巢排卵移植準胎率分別為３５．１４％和４３．１５％，差異極顯著（Ｐ＜０．０１）；春季與秋季的移植準胎率分別為３６．９３％和４３．５３％，秋季明顯高于春季，差異極顯著（Ｐ＜０．０１）；黃牛不同黃體級別Ａ級、Ｂ級、Ｃ級的準胎率分別為３９．１６％、４１．７０％和３３．４２％，Ａ級與Ｂ級移植準胎率差異不顯著（Ｐ＞０．０５），Ｂ級與Ｃ級移植準胎率差異極顯著（Ｐ＜０．０１）；移植單胚與雙胚的受體牛準胎率分別為４０．７３％和３８．２４％，差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。

關鍵詞：魯西黃牛；胚胎移植；高產奶牛

中圖分類號：Ｓ８２３．３＋６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1407-03

Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｓ ｆｒｏｍ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｃｏｗｓ ｔｏ Ｌｕｘｉ Ｃａｔｔｌｅ

ＪＩＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ，ＳＩ Ｚｈｅｎ－ｓｈｕ，ＷＡＮＧ Ｇｕｉ－ｙｉｎｇ

（Department of Animal Sciences，Ｉｎｓｔｉｔｕtｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ ２５２０５９，Sｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｅｍａｌｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｍｂｒｙｏｓ ｏｆ ７ ｄａｙｓ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｃｏｗｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｔｏ ５ ５１６ Ｌｕｘｉ ｃａｔｔｌｅ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｅｓｔｒｕｓ， ２ ２２８ ｃａｔｔｌｅ ｗｅｒｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ 60~80 ｄａｙｓ later according to ｒｅｃｔａｌ ｐａｌｐａｔｉｏｎ detection； ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒａｔｅ ｗａｓ ４０．３９％． １ ３４６ ｃａｌｖｅｓ ｗｅｒｅ ｂｏｒｎ， including １ ２７９ ｆｅｍａｌｅｓ ａｎｄ ６７ ｍａｌｅｓ； ｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｒａｔｅ ｗａｓ ９５．０２％． Ｔｈｅｒｅ was ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｅｆｔ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ ｏｖａｒｙ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ３５．１４％ ａｎｄ ４３．１５％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒａｔｅ ｉｎ ａｕｔｕｍｎ ｗａｓ ４３．５３％， ｗｈｉｃｈ was ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ３６．９３％ ｉｎ ｓｐｒｉｎｇ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒａｔｅ ｉｎ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｒｐｕｓ ｌｕｔｅｕｍ ｇｒａｄｅ Ａ， Ｂ ａｎｄ Ｃ ｗｅｒｅ ３９．１６％， ４１．７０％ ａｎｄ ３３．４２％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｒａｄｅ Ａ ａｎｄ Ｂ（Ｐ＞０．０５）， ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｒａｄｅ Ｂ ａｎｄ Ｃ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｔｗｉｎ ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（Ｐ＞０．０５）， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒａｔｅ ｏｆ ４０．７３％ ａｎｄ ３８．２４％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ （Ｐ＞０．０５）．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃａｔｔｌｅ； ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ； ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｃｏｗ

山東省聊城市地處魯西平原，有著豐富的黃牛資源，魯西黃牛體軀高大，繁殖力較強，母牛一般８～１０月齡即可配種懷胎，終生可產犢７～１０頭，產仔率較高；其前軀發育好，肌肉發達，體質結實，結構勻稱，適應性強，耐粗飼，飼養成本較低，是高產奶牛胚胎移植的理想受體。魯西黃牛多為小規模飼養和散養，同期發情處理技術較難適用，因此在聊城市周邊鄉鎮分設四個移植站，以農村自然發情的黃牛為受體，利用高產奶牛性控胚胎進行了大規模的胚胎移植，這對提高我國奶牛質量，增加良種奶牛的數量，促進我國奶牛產業化發展具有積極意義，同時具有較高的推廣應用價值。

１ 材料與方法

１．１ 高產奶牛性控雌性冷凍胚胎

由美國向中公司提供。選用年產奶量８ ０００ ｋｇ以上母牛卵母細胞經過體外培養，采用性控技術受精發育而成的７日齡冷凍胚胎。

１．１．１ 主要儀器 玻璃針、吸胚管、培養皿、過濾器、移植槍、四孔板、加熱板、液氮罐、顯微鏡、酒精燈等。

１．１．２ 胚胎解凍 解凍過程需在實驗室內無菌操作，按說明書要求進行。美國向中公司的凍胚為顆粒胚胎，每粒有小米粒大小，內有４枚胚胎，所需解凍液、基礎液、漂洗液、移植液均由該公司提供。步驟為：從液氮罐中取出顆粒胚胎直接放入解凍液，時間為３５ ｓ以內；將胚胎從解凍液中取出放入基礎液，時間為５ ｍｉｎ；然后將胚胎取出放入漂洗液，３～５ ｍｉｎ；最后將胚胎放入移植液，０～２ ｈ。

１．１．３ 胚胎的檢查 發育正常的胚胎其透明帶基本呈圓形，卵裂球均勻而緊湊，無滲出細胞；卵裂球分散或變性后一般不能用于移植。經檢查合格的胚胎達到Ａ、Ｂ級，備用。

１．２ 受體母牛的準備

１．２．１ 受體母牛的選擇 選用聊城市散養的魯西黃牛或雜交牛，要求身體健康，無結核、布病等疫病，年齡在１．５歲以上，１０歲以下，有正常的繁殖能力和發情周期，體型大，體質健壯，自然發情。

１．２．２ 受體母牛的鑒定 技術人員對發情母黃牛進行穩欄鑒定。

１．３ 胚胎的移植

１．３．１ 受體牛的保定和消毒 經穩欄鑒定合格的母牛，鑒定當天為０ ｄ，到第７天時進行胚胎移植。將受體牛站立保定于保定架內，用溫水和肥皂水清洗外陰部，擦干后用消毒液沖洗。檢查受體母牛排卵側黃體發育情況，經檢查黃體達到Ａ級或Ｂ級的為合格受體牛。為了使受體牛在移植過程中保持安靜，可用２％普魯卡因或利多卡因進行薦尾部硬膜腔麻醉［１］。

１．３．２ 輸入胚胎 將解凍后檢查合格的胚胎裝入移植槍，移植槍通過直腸把握法送入子宮角小彎處，隨后將胚胎推入。胚胎輸入過程越短越好，一般操作時間不應超過１０ ｍｉｎ，要做到輕、穩、快，防止用力不當損傷子宮造成感染。

１．３．３ 受體母牛胚胎移植后的觀察 胚胎移植后要注意受體母牛的健康狀況，同時密切關注其在下一個發情周期是否發情。出現發情說明尚未受胎，移植失敗，需要重新移植；移植后２個月不返情，６０～８０ ｄ做直腸孕檢確定是否準胎。

２ 結果

２．１ 移植準胎率及性控比例結果

共移植受體牛５ ５１６頭，６０～８０ ｄ直腸孕檢懷孕的有２ ２２８頭，移植準胎率為４０．３９％（表1）；共繁殖奶牛犢牛１ ３４６頭，其中母牛１ ２７９頭，公牛６７頭，胚胎性別控制率為９５．０２％。其中許營、李海務、沙鎮、高集四個移植站的移植準胎率分別為３８．５７％、４０．７３％、４２．３６％、４９．４７％，高集與許營站之間差異極顯著（Ｐ＜０．０１）。不同移植站點技術人員不同，說明技術人員的操作水平對準胎率有很大的影響。

２．２ 移植季節對準胎率的影響

以自然發情的黃牛為受體移植高產奶牛胚胎，主要在每年春、秋兩季進行。由表２可知，春、秋季的移植準胎率分別為３６．９３％、４３．5３％，秋季明顯高于春季，差異極顯著（Ｐ＜０．０１）。

２．３ 不同側卵巢排卵對準胎率的影響

由表3可知，移植的５ ５１６頭受體牛中，右側卵巢排卵的為３ ６１８頭，占總數的６５．５９％，左側排卵的為１ ８９８頭，占總數的３４．４１％，右側比左側排卵的機率高近１倍，左側與右側卵巢排卵移植準胎率分別為３５．１４％、４３．１５％，右側卵巢排卵移植準胎率顯著高于左側，差異極顯著（Ｐ＜０．０１）。

２．４ 黃體不同發育程度對準胎率的影響

采用直腸觸摸法判斷黃體發育情況，把黃體發育分為３級（即Ａ、Ｂ、Ｃ級），達到Ｂ級以上方能輸胚，Ｃ＋以上勉強輸胚，Ｃ級以下放棄輸胚［２］。移植的５ ５１６頭受體牛中，黃體發育達到Ｂ級的為最多，占７９．３９％，移植準胎率也最高。由表４可知，Ａ級、Ｂ級、Ｃ級的移植準胎率分別為３９．１６％、４１．７０％、３３．４２％，分析表明，Ａ級與Ｂ級移植準胎率差異不顯著（Ｐ＞０．０５），Ｂ級與Ｃ級移植準胎率差異極顯著（Ｐ＜０．０１）。

２．５ 移植雙胚與單胚對準胎率的影響

移植過程中，由于受體牛的不確定性，而胚胎解凍后又無條件重新冷凍，因此，在移植過程中對受體牛輸入了部分雙胚。由表5可見，移植雙胚與單胚的受體牛準胎率分別為３８．２４％、４０．７３％，差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。

３ 討論

體外胚胎移植研究是近年來被關注的熱點，我國僅在移植成功方面有報道［３］，但一般移植規模較小。本試驗采用進口高產奶牛的雌性冷凍胚胎，利用本地散養自然發情的黃牛為受體進行規模化胚胎移植，移植準胎率達到４０．３９％，移植出生的１ ３４６頭犢牛中，母牛１ ２７９頭，公牛６７頭，胚胎性別控制率為９５．０２％，達到了性控目的。

移植過程中，技術人員的操作水平對準胎率有很大影響。移植過程包括３個階段：①胚胎解凍。不同解凍人員的操作不盡相同，從而影響到胚胎質量；另一方面解凍人員對合格胚胎認識不同，同一胚胎有人認為合格可以裝槍，有人則認為不合格不能裝槍，結果造成胚胎在裝槍時質量有差別，進而影響到移植準胎率。②穩欄鑒定。不同技術人員對穩欄的理解不同，影響輸胚時間的確定，從而影響移植準胎率。③輸胚。輸胚人員的技術操作對準胎率的影響表現在四個方面：對受體牛排卵后所形成的黃體判定是否準確；胚胎是否送到所要求的準確部位；輸胚過程中是否對子宮造成損傷以及損傷程度；對受體牛的外陰部消毒清洗是否嚴格。

春、秋季的移植準胎率不同，秋季明顯高于春季，分析其原因，受體牛雖然在春季有明顯的發情表現，但發情母牛經過較長時間的冬季，飼料匱乏，飼料中營養物質含量低，大多數母牛營養狀況不良，特別是蛋白質、礦物質和維生素等營養素不足。同時，春季外界氣溫較低，氣候多變，也對胚胎移植工作帶來不利因素，影響了準胎率的提高；而秋季受體牛的營養狀況相對較好，氣候也比較平穩，從而移植成功率高。

右側卵巢排卵移植準胎率顯著高于左側，表明右側卵巢較左側卵巢活躍［４，５］。與正常情況下黃牛自然發情大多為右側排卵的觀點一致。

黃體發育程度對移植準胎率有一定影響。試驗結果表明，只要功能黃體發育達到Ｂ級以上，就能進行正常胚胎移植；反之移植準胎率可能偏低，不利于移植生產。

移植雙胚與單胚的受體牛準胎率分別為３８．２４％和４０．７３％，差異不顯著。分析認為，牛是單胎動物，自然發情狀態下的雙胎率很低，人為移植雙胚影響了牛正常的生理狀態，反而使準胎率受到影響。

本研究胚胎移植規模之大，在國內還未見報道。總的看來，利用本地散養、自然發情的黃牛為受體進行規模化移植是可行的，適合我國黃牛存欄多、飼養分散的基本國情，為充分利用我國黃牛資源生產純種高產奶牛、增加高產奶牛的數量及提高質量、解決國民對牛奶的需求展現了良好的市場前景。

參考文獻：

［１］ 江 成，徐光勇， 王 蕓， 等． 奶牛性別控制胚胎移植研究報告［Ｊ］． 當代畜牧，２００７（２）：３８－４０．

［２］ 邱長興，王 蕓， 江 成． 影響黃牛移植奶牛胚胎準胎率的因素［Ｊ］．當代畜牧，２００７（１１）：４２－４４．

［３］ 朱化彬，敖 紅， 劉云海， 等． 牛活體采集卵母細胞技術的研究［Ｊ］．中國畜牧，２００１，３７（２）：２８－２９．

［４］ 張俊功，仲躋峰，王文英，等．引進良種肉牛凍胚規模移植技術研究［Ｊ］．畜牧獸醫學報，２００１，３２（４）：２８９－２９４．

［５］ 胡松廷．肉牛生產學［Ｍ］．濟南：山東大學出版社，１９９３．１００－１０１．