HPLC法同時測定重酒石酸去甲腎上腺素注射液和鹽酸去氧腎上腺素注射液的含量及有關物質

摘 要 目的：建立測定重酒石酸去甲腎上腺素注射液和鹽酸去氧腎上腺素注射液含量及有關物質的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱：Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 micro;m)；流動相：甲醇-乙腈-庚烷磺酸鈉溶液（1∶1∶8）；檢測波長：280 nm；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃。結果：重酒石酸去甲腎上腺素在80～320 μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系，r=0.999 8；高、中、低3種濃度的平均回收率為101.2%，RSD為0.18%(n=9)。重酒石酸去甲腎上腺素的最小檢測限為152.3 ng/ml。鹽酸去氧腎上腺素在100～400 μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系，r=0.999 6；高、中、低3種濃度的平均回收率為98.1%，RSD為0.051%(n=9)。鹽酸去氧腎上腺素的最小檢測限為103.8 ng/ml。結論：該法簡便、準確、靈敏度高，重現性好，可用于重酒石酸去甲腎上腺素注射液和鹽酸去氧腎上腺素注射液的含量測定和有關物質檢查。

關鍵詞 高效液相色譜法 重酒石酸去甲腎上腺素 鹽酸去氧腎上腺素 注射液 含量測定 有關物質

中圖分類號：O657.72；R927.2 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533(2012)07-0038-04

Simultaneous determination of both norepinephrine bitartrate injection and phenylephrine hydrochloride injection and their related substances by HPLC method

SUN Ke-gang， SHI Jian-guo， JIANG Yu-dan

(Shanghai Harvest Pharmaceutical Co.， Ltd， Shanghai， 201206)

ABSTRACT Objective: To establish a methods for the determination of both norepinephrine bitartrate injection and phenylephrine hydrochloride injection and their related substances. Methods: An HPLC was performed on a column of Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm) with the mobile phase of methanol - acetonitrile - sodium heptane solution (1：1：8) at detection wavelength of 280 nm， flow rate of 1.0 ml/min and column temperature of 30 ℃. Results: For norepinephrine bitartrate， the calibration curve was linear (r=0.999 8) over the range of 80～320 μg/ml， the average recovery was 101.2% with RSD 0.18% and the limit of detection was 152.3 ng/ml. For phenylephrine hydrochloride， the calibration curve was linear (r=0.999 6) over the range of 100～400 μg/ml， the average recovery was 98.1% with RSD 0.051% and the limit of detection was 103.8 ng/ml. Conclusion: This method is simple， accurate， sensitive and good reproducible， which can be applied in the determination of both norepinephrine bitartrate injection and phenylephrine hydrochloride injection and their related substances.

KEY WORDS HPLC； norepinephrine bitartrate ；phenylephrine hydrochloride； injection；assay； related substances

重酒石酸去甲腎上腺素和鹽酸去氧腎上腺素均為腎上腺素受體激動藥，具有收縮血管的作用。臨床上用于治療休克及維持血壓。重酒石酸去甲腎上腺素注射液[1]和鹽酸去氧腎上腺素注射液[2]均為《中國藥典》2010年版二部收載品種。重酒石酸去甲腎上腺素注射液的含量和有關物質測定均為高效液相色譜法，但色譜條件不同，鹽酸去氧腎上腺素注射液含量測定方法采用溴量法，有關物質測定采用薄層色譜法。故將兩種注射液的含量測定及有關物質測定方法進行統一，以方便生產檢驗。我們采用同一種色譜條件[3]測定重酒石酸去甲腎上腺素注射液和鹽酸去氧腎上腺素注射液含量及有關物質。

1 儀器與試藥

美國Agilent 1100高效液相色譜儀，VWD紫外檢測器，Sartorius CPA225D電子天平。重酒石酸去甲腎上腺素：武漢武藥制藥有限公司；鹽酸去氧腎上腺素：深圳沃蘭德藥業有限公司；重酒石酸去甲腎上腺素注射液（規格：1 ml：2 mg）和鹽酸去氧腎上腺素注射液(規格：1 ml∶10 mg)由本公司提供。乙腈、甲醇、庚烷磺酸鈉為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 重酒石酸去甲腎上腺素注射液的溶液制備

1）供試品溶液的制備 取重酒石酸去甲腎上腺素注射液適量，加4%醋酸溶液稀釋制成0.16 mg/ml的溶液。

2）對照品溶液的制備 精密稱取重酒石酸去甲腎上腺素對照品適量，加4%醋酸溶液制成0.16 mg/ml的溶液。

3）有關物質對照溶液的制備 精密量取供試品溶液1 ml，置100 ml量瓶中，用4%醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻。

4）有關物質對照品溶液的制備 精密稱取腎上腺素對照品適量，加4%醋酸溶液稀釋成1.6 micro;g/ml的溶液，作為對照品溶液。

2.2 鹽酸去氧腎上腺素注射液的溶液制備

1）供試品溶液的制備 取鹽酸去氧腎上腺素注射液適量，加流動相制成0.2 mg/ml的溶液。

2）對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸去氧腎上腺素對照品適量，加流動相制成0.2 mg/ml的溶液。

3）對照溶液的制備 精密量取供試品溶液1 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。

2.3 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 micro;m)。流動相：甲醇-乙腈-庚烷磺酸鈉溶液（取庚烷磺酸鈉1.76 g，加水溶解并稀釋至800 ml，搖勻）（1：1：8）[3]。檢測波長：280 nm；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 micro;l。

2.4 系統適用性試驗

取重酒石酸去甲腎上腺素對照品10 mg，加0.1 mol/L鹽酸5 ml使溶解，取1 ml，加30%過氧化氫溶液0.1 ml，搖勻，在紫外光燈（254 nm）下照射90 min，加流動相9 ml，搖勻，作為系統適用性試驗溶液[3]。取系統適用性試驗溶液20 micro;l，注入液相色譜儀，除主成分峰外，應有相對保留時間1.2和1.5的兩個降解峰，主峰與兩個降解產物之間的分離度均應符合要求。理論板數按去甲腎上腺素峰計算不低于2 000(圖1)。

2.5 專屬性試驗

分別取空白輔料溶液及“2.1”項下的兩種注射液的供試品溶液、對照品溶液各20 micro;l，進樣，結果表明空白輔料不干擾重酒石酸去甲腎上腺素注射液和鹽酸去氧腎上腺素注射液的含量測定。見圖2、3。

2.6 線性關系及范圍

分別精密稱取重酒石酸去甲腎上腺素適量，按“2.1 2）”配制成約80、128、160、192、256、320 μg/ml的溶液，按“2.3”項下測定，記錄色譜圖。以重酒石酸去甲腎上腺素峰面積(X)對其質量濃度(Y，mg/ml)進行回歸，得重酒石酸去甲腎上腺素腎上腺素回歸方程為：Y=9.350×103X-113.2，r=0.999 8。結果表明重酒石酸去甲腎上腺素在80～320 μg/ml范圍內與峰面積線性關系良好。

分別精密稱取鹽酸去氧腎上腺素適量，按“2.2 2）”配制成約100、160、200、240、320、400 μg/ml的溶液，按“2.3”項下測定，記錄色譜圖。以鹽酸去氧腎上腺素峰面積(X)對其質量濃度(Y，mg/ml)進行回歸，得鹽酸去氧腎上腺素回歸方程為：Y=28.65+8.126×103X，r=0.999 6。結果表明鹽酸去氧腎上腺素在100～400 μg/ml范圍內與峰面積線性關系良好。

2.7 檢測限的考察

按信噪比3:1測得重酒石酸去甲腎上腺素和鹽酸去氧腎上腺素的最小檢測限分別為152.3 ng/ml和103.8 ng/ml。

2.8 精密度試驗

配制含量測定供試品溶液共6份，分別進樣20 micro;l，重酒石酸去甲腎上腺素注射液的標示量RSD值為0.20%；鹽酸去氧腎上腺素注射液的標示量RSD值為0.65%。

2.9 回收試驗

按處方量的80%、100%、120%并分別按“2.1”和“2.2”配制128、160、192 μg/ml的重酒石酸去甲腎上腺素溶液和160、200、240 μg/ml的鹽酸去氧腎上腺素溶液，按照“2.3”項下方法測定，計算得重酒石酸去甲腎上腺素的平均回收率為101.2%，RSD值為0.18%(n=9)；鹽酸去氧腎上腺素的平均回收率為98.1%，RSD值為0.051%(n=9)。

2.10 含量測定

取對照品溶液、供試品溶液各20 micro;l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算含量。將重酒石酸去甲腎上腺素注射液三批和鹽酸去氧腎上腺素注射液三批含量測定結果分別與《中國藥典》2010年版方法比較，差異不大(表1、2)，但方法更簡便。

2.11 有關物質的測定

精密量取系統適用性試驗溶液、供試品、有關物質對照品溶液與對照溶液各20 micro;l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液的色譜圖中如有與腎上腺素峰保留時間一致的色譜峰，按外標法以峰面積計算，不得過重酒石酸去甲腎上腺素標示量的1.0%；扣除溶劑與輔料峰，與輔料峰相鄰的最大色譜峰不得大于對照溶液主峰面積的10倍（10.0%）；其他單個雜質峰面積不得大于對照液主峰面積的0.5倍（0.5%），其他各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積（1.0%）(表3、圖4)。

取供試品溶液、對照溶液各20 micro;l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液如顯雜質峰，除溶劑與輔料峰外，單個雜質峰面積不得大于對照液主峰面積的0.5倍（0.5%），各雜質峰面積之和不得大于對照溶液的峰面積(1.0%)(表4、圖5)。

2.12 重酒石酸去甲腎上腺素與鹽酸去氧腎上腺素的同時測定

取重酒石酸去甲腎上腺素注射液與鹽酸去氧腎上腺素注射液供試品溶液各1 ml與6 ml，混勻，進樣20 micro;l，結果去甲腎上腺素與去氧腎上腺素兩峰分離效果良好（圖6）。

3 討論

經實驗，本法簡單易行，精密度高，優于中國藥典法，可同時檢驗重酒石酸去甲腎上腺素注射液和鹽酸去氧腎上腺素注射液。

紫外掃描圖顯示重酒石酸去甲腎上腺素和鹽酸去氧腎上腺素均在280 nm波長有最大吸收，因此選擇280 nm波長作為檢測波長。

重酒石酸去甲腎上腺素注射液和鹽酸去氧腎上腺素，光照、高溫破壞后降解產物較少，酸、堿、氧化破壞后均產生大量降解產物。但主成分與降解產物的分離度均符合要求，不干擾重酒石酸去甲腎上腺素注射液和鹽酸去氧腎上腺素注射液含量及有關物質測定。

美國藥典34版對重酒石酸去甲腎上腺素注射液和鹽酸去氧腎上腺素注射液均未進行有關物質考察[4，5]。重酒石酸去甲腎上腺素分子結構中具有兒茶酚（鄰苯二酚）結構，性質不穩定，接觸空氣或受日光照射，極易被氧化變質，故制成注射液需加入焦亞硫酸鈉作為抗氧劑。但焦亞硫酸與鄰苯二酚易生成磺化物，且通過本文所研究的色譜方法可對該磺化物進行分析，但還須對該磺化物生成過程進行進一步研究確認，且在有必要時應進行相關的藥理毒理研究。而鹽酸腎上腺素分子結構中只有一個酚羥基，在其制劑處方中添加抗氧劑后，未檢測出磺化物，證明鹽酸去氧腎上腺素相比重酒石酸去甲腎上腺素要穩定得多。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 2010年版（二部）[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社， 2010: 571-572.

[2] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典: 2010年版（二部）[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社， 2010: 643-644.

[3] 孫克剛， 施建國， 蔣宇丹. HPLC法同時測定鹽酸異丙腎上腺素注射液和鹽酸腎上腺素注射液的含量及有關物質[J]. 上海醫藥， 2012， 33(5): 41-44.

[4] The United States Pharmacopeial Convention . USP34-NF29[M]. Rockcille: The United States Pharmacopeial Convention， 2011: 3679.

[5] The United States Pharmacopeial Convention . USP34-NF29[M]. Rockcille: The United States Pharmacopeial Convention， 2011: 3904.

（收稿日期：2012-03-16）