siRNA－Gli－1聯(lián)合BCNU抑制膠質(zhì)瘤細胞U251增殖

田海龍，李惠武，李 卉，段明軍，姜孝芳，白靖平*

(新疆醫(yī)科大學1.附屬腫瘤醫(yī)院;2.基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞與分子生物教研室;3.第一附屬醫(yī)院醫(yī)學中心，新疆烏魯木齊830000)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率占原發(fā)顱內(nèi)腫瘤第1位。臨床針對膠質(zhì)瘤進行手術(shù)輔助放化療的綜合治療，但治療效果并不理想。近年來發(fā)現(xiàn)Hedgehog(Hh)信號通路的異常激活在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。該通路通常通過核轉(zhuǎn)錄因子Gli-1(glioma-associated oncogene homolog 1，Gli-1)發(fā)揮作用。Gli-1成為Hh信號最終的響應者和功能的執(zhí)行者，其核酸水平的表達是Hh通路早期活化的標志，是整個通路最主要的環(huán)節(jié)［1－2］，Gli-1的異常高表達可能促進膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展。

卡莫司汀(carmustine，BCNU)是治療腦腫瘤常用的藥物之一，但靜脈注射該藥對骨髓、肝臟和肺臟的不良反應大，限制藥物的臨床應用［3］。為探索更理想的膠質(zhì)瘤治療方法，本研究觀察siRNA聯(lián)合BCNU影響膠質(zhì)瘤細胞凋亡和增殖的作用效果，探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人膠質(zhì)瘤U251細胞(中國科學院上海細胞生物學研究所);RPMI1640和胎牛血清(Gibco公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Trizol(Invitrogen公司);AnnexinⅤ凋亡試劑(上海晶美公司);siRNA和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(上海吉瑪公司);兔抗人 Gli-1、BCL-2、cycinD1和BAX多克隆抗體(武漢博士德公司);Western blot試劑盒及碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)(Sigma公司);BCNU注射液(上海伊明公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞系培養(yǎng):含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%滅活胎牛血清的RPMI1640作為培養(yǎng)基，復蘇U251膠質(zhì)瘤細胞，5%CO2、37℃培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 siRNA-Gli-1合成、轉(zhuǎn)染及濃度篩選:根據(jù)人Gli-1序列(Genbank，NM_00116 0045)中轉(zhuǎn)錄RNA的作用位置及小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)設(shè)計原則，確定人Gli-1的siRNA目標寡核苷酸……